一种低免疫原性的海洋医用胶原蛋白及其制备方法及应用技术

本发明专利技术提出了一种低免疫原性的海洋胶原蛋白及其制备方法和应用。所述低免疫原性的海洋胶原蛋白的制备方法包括：对鱼皮进行预处理、脱脂及除杂蛋白、去除糖蛋白及内毒素、粗提取、盐析、去端肽、脱盐、包装及灭菌，得到一种低免疫原性的海洋胶原蛋白。本发明专利技术通过合理的免疫原性物质去除手段，除去端肽、糖蛋白及内毒素等富含胶原蛋白的天然组织中存在的免疫原性物质，同时还可去除细胞抗原，使机体的免疫反应大大降低，从而减少了材料的免疫原性。所述低免疫原性的海洋胶原蛋白具有纯度高、保持三螺旋结构、活性强、性能好等特点，提供海洋胶原蛋白基医用材料和医疗器械开发的物质基础和技术保证。

【技术实现步骤摘要】
一种低免疫原性的海洋医用胶原蛋白及其制备方法及应用
本专利技术属于医用材料制备
，具体涉及一种低免疫原性的海洋医用胶原蛋白及其制备方法及应用。
技术介绍
近年来，对胶原蛋白的研究已拓展到了生物医用领域。由于胶原蛋白在细胞外基质中的优势，以及其具有的生物可降解性、低免疫原性和良好的生物相容性等特点，使其在医学和组织工程中的应用越来越广泛。目前胶原蛋白已被成功应用于止血海绵、可吸收手术缝合线、植入性胶原蛋白膜、组织工程软骨、药物缓释载体等的制备中。市场对医用胶原蛋白的需求保持高速增长，医用胶原蛋白行业在国民经济中的地位将不断提高。预测未来几年医用胶原蛋白产品国产品牌会慢慢崛起，产品慢慢向高端市场渗透，市场占有率会越来越高。海洋生物在地球上种类繁多、数量巨大，是胶原蛋白来源的宝库。国内外学者以已经从各种水生生物的皮、鳞和骨中分离和表征了多种海洋胶原蛋白，并证明海洋胶原蛋白既存在与陆生胶原蛋白类似的特征，又具有陆生胶原蛋白所没有的人群优势、安全优势以及资源优势。相比于陆生哺乳动物，水生生物胶原蛋白在功能特性上具有较多的优点，如低乳化性、高分散性和低免疫原性等，在组织骨架、止血敷料、创伤修复膜等领域具有巨大的应用潜力。但是，在市场调研及课题组前期的研究中发现，目前所用用到的医用胶原蛋白产品均为哺乳动物中获得的，并没有以海洋来源胶原蛋白制备的医疗器械及海洋动物来源的胶原蛋白材料。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种低免疫原性的海洋医用胶原蛋白及其制备方法及应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种低免疫原性的海洋医用胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：（1）鱼皮原料预处理：取海洋来源鱼类，去头、去内脏、除去鱼鳞，进行鱼皮肉分离，将得到的鱼皮洗净，沥干；（2）原料脱脂及除杂蛋白：取步骤（1）预处理后的鱼皮，加入碱溶液搅拌，过滤后调整酸碱度至中性，获得除杂后的鱼皮；（3）鱼皮糖蛋白及内毒素的去除：在步骤（2）获得的鱼皮中加入过氧化氢溶液、氢氧化钠，搅拌至鱼皮变为淡黄色，过滤后调整酸碱度至中性，获得除去表面糖蛋白及部分内毒素的鱼皮；（4）鱼皮胶原蛋白的粗提取：在步骤（3）获得的鱼皮中加入酸性溶液后搅拌，离心取上清液，获得胶原蛋白粗提液；（5）胶原蛋白的盐析：加入盐进行盐析，收集沉淀，获得胶原蛋白沉淀；（6）鱼皮胶原蛋白端肽的去除：将所述步骤（5）获得的胶原蛋白沉淀溶于酸性溶液中，加入蛋白酶后水解去端肽，使用弱碱溶液作为透析液进行，获得去端肽胶原蛋白；（7）去端肽胶原蛋白的脱盐：步骤（6）中去端肽胶原蛋白酸碱度为中性后，再透析脱盐，得到高纯度的去端肽医用海洋胶原蛋白溶液；（8）去端肽医用海洋胶原蛋白的干燥及内毒素清除：真空冷冻干燥机中干燥步骤（7）获得的高纯度的去端肽医用海洋胶原蛋白溶液，进行包装及灭菌，得到所述低免疫原性的海洋医用胶原蛋白。进一步的，所述步骤（2）中的碱溶液、所述步骤（3）中的过氧化氢溶液进行2~8℃预冷；所述步骤（4）的搅拌温度、所述步骤（5）的盐析温度为2~8℃。进一步的，所述步骤（1）中的海洋来源鱼类包括鳕鱼、罗非鱼。进一步的，所述步骤（2）中鱼皮与碱性溶液的料液比为1:10~1:20（w/v），所述碱溶液的浓度为0.1~0.2M。进一步的，所述的步骤（2）使用的碱性溶液的溶质为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾或氢氧化钠中的至少一种。进一步的，所述步骤（3）中鱼皮与过氧化氢溶液的料液比为1:10~1:20（w/v）；所述过氧化氢溶液的浓度为1%~2%；所述氢氧化钠在整个体系中的浓度为0.03~0.08M。进一步的，所述步骤（4）中鱼皮与酸性溶液的料液比为1:50~1:65（w/v），所述酸性溶液的浓度为0.3~0.5M。所述酸性溶液为醋酸溶液、柠檬酸溶液或盐酸溶液。进一步的，所述步骤（5）中盐的最终浓度为0.8~1.0M；所述盐为NaCl。进一步的，所述步骤（6）中的蛋白酶为胃蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶。进一步的，所述步骤（6）中蛋白酶的用量为300~600U/g；水解温度为4~8℃；透析过程使用分子量小于14000Da的透析袋；透析液为0.2M弱碱溶液。进一步的，所述步骤（7）中透析液为生理盐水或去离子水，透析至电导率为50us/cm以下。进一步的，所述步骤（8）中采用辐照灭菌。本专利技术还提供了所述制备方法制得的低免疫原性的海洋医用胶原蛋白。本专利技术提供所述低免疫原性的海洋医用胶原蛋白在制备医用胶原蛋白中的应用。进一步的，所述低免疫原性的海洋医用胶原蛋白的羟脯氨酸含量为9.0~9.2%；核酸含量低于300ng/mg。与现有技术相比，本专利技术的优点和有益效果是：本专利技术是以富含胶原蛋白的海洋鱼类鱼皮、鱼鳞、鱼鳔等为原料，开发医用海洋胶原蛋白的制备纯化技术、免疫原消除技术、功能改性技术等关键技术，并针对特定医用需求的海洋胶原蛋白材料，按照《中华人民共和国医药行业标准》中的《动物源医疗器械风险管理标准》和《注册技术审查指导原则》进行全面的安全性评价及生物相容性研究，完成了高纯度、低免疫原性的医用海洋胶原蛋白的研制开发。本专利技术制备方法工艺简单、反应温度低，制备得到的医用胶原蛋白，对医用级海洋胶原蛋白关键制备技术的突破和开发，是海洋胶原蛋白基医用材料和医疗器械开发的物质基础和技术保证。本专利技术克服了现有的海洋来源的医用胶原蛋白产品开发中存在的纯度低、免疫原性高等问题，提供一种低免疫原性海洋来源胶原蛋白的制备方法，海洋胶原蛋白的热变性温度较低，提取过程中采用低温防止胶原蛋白变形，保证了胶原蛋白的三螺旋结构和分子量，具有活性强的特点。通过合理的免疫原性物质去除手段，除去端肽、糖蛋白及内毒素等富含胶原蛋白的天然组织中存在的免疫原性物质，同时还可去除细胞抗原，使机体的免疫反应大大降低，从而减少了材料的免疫原性，为海洋来源的医用胶原蛋白材料的临床安全性研究提供了依据，也为后续开发基于海洋胶原蛋白的医用材料及医疗器械提供理论依据及技术保证。附图说明图1是三种海洋胶原蛋白丹巴SDS-PAGE图；图中标号：1、罗非鱼鱼皮胶原蛋白；2、鳕鱼鱼皮胶原蛋白；3、鮰鱼鱼皮胶原蛋白。图2是两种胶原蛋白的端肽去除率检测结果。图3是两种去端肽胶原蛋白对细胞免疫的影响。图4是低免疫原性海洋胶原蛋白的皮内刺激试验结果。图5是胶原蛋白的急性全身毒性实验结果。具体实施方式下述实施方式更好地说明本
技术实现思路
。但本专利技术不限于下述实施例。本专利技术所述的低免疫原性的海洋医用胶原蛋白的制备方法如下：（1）鱼皮原料的预处理：取真鳕鱼及罗非鱼等海洋来源鱼类，去头、去内脏、除去鱼鳞，利用去皮机完成鱼皮肉分离，将得到的鱼皮洗净，绞碎成5×5mm左右的小块，沥干水分，称重。（2）原料脱脂及除杂蛋白：取30g预处理的鱼皮，按照料液比为1:10~1:2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低免疫原性的海洋医用胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：/n（1）鱼皮原料预处理：取海洋来源鱼类，去头、去内脏、除去鱼鳞，进行鱼皮肉分离，将得到的鱼皮洗净，沥干；/n（2）原料脱脂及除杂蛋白：取步骤（1）预处理后的鱼皮，加入碱溶液搅拌，过滤后调整酸碱度至中性，获得除杂后的鱼皮；/n（3）鱼皮糖蛋白及内毒素的去除：在步骤（2）获得的鱼皮中加入过氧化氢溶液、氢氧化钠，搅拌至鱼皮变为淡黄色，过滤后调整酸碱度至中性，获得除去表面糖蛋白及部分内毒素的鱼皮；/n（4）鱼皮胶原蛋白的粗提取：在步骤（3）获得的鱼皮中加入酸性溶液后搅拌，离心取上清液，获得胶原蛋白粗提液；/n（5）胶原蛋白的盐析：加入盐进行盐析，收集沉淀，获得胶原蛋白沉淀；/n（6）鱼皮胶原蛋白端肽的去除：将所述步骤（5）获得的胶原蛋白沉淀溶于酸性溶液中，加入蛋白酶后水解去端肽，使用弱碱溶液作为透析液进行，获得去端肽胶原蛋白；/n（7）去端肽胶原蛋白的脱盐：步骤（6）中去端肽胶原蛋白酸碱度为中性后，再透析脱盐，得到高纯度的去端肽医用海洋胶原蛋白溶液；/n（8）去端肽医用海洋胶原蛋白的干燥及内毒素清除：真空冷冻干燥机中干燥步骤（7）获得的高纯度的去端肽医用海洋胶原蛋白溶液，进行包装及灭菌，得到所述低免疫原性的海洋医用胶原蛋白。/n...

【技术特征摘要】
1.一种低免疫原性的海洋医用胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
（1）鱼皮原料预处理：取海洋来源鱼类，去头、去内脏、除去鱼鳞，进行鱼皮肉分离，将得到的鱼皮洗净，沥干；
（2）原料脱脂及除杂蛋白：取步骤（1）预处理后的鱼皮，加入碱溶液搅拌，过滤后调整酸碱度至中性，获得除杂后的鱼皮；
（3）鱼皮糖蛋白及内毒素的去除：在步骤（2）获得的鱼皮中加入过氧化氢溶液、氢氧化钠，搅拌至鱼皮变为淡黄色，过滤后调整酸碱度至中性，获得除去表面糖蛋白及部分内毒素的鱼皮；
（4）鱼皮胶原蛋白的粗提取：在步骤（3）获得的鱼皮中加入酸性溶液后搅拌，离心取上清液，获得胶原蛋白粗提液；
（5）胶原蛋白的盐析：加入盐进行盐析，收集沉淀，获得胶原蛋白沉淀；
（6）鱼皮胶原蛋白端肽的去除：将所述步骤（5）获得的胶原蛋白沉淀溶于酸性溶液中，加入蛋白酶后水解去端肽，使用弱碱溶液作为透析液进行，获得去端肽胶原蛋白；
（7）去端肽胶原蛋白的脱盐：步骤（6）中去端肽胶原蛋白酸碱度为中性后，再透析脱盐，得到高纯度的去端肽医用海洋胶原蛋白溶液；
（8）去端肽医用海洋胶原蛋白的干燥及内毒素清除：真空冷冻干燥机中干燥步骤（7）获得的高纯度的去端肽医用海洋胶原蛋白溶液，进行包装及灭菌，得到所述低免疫原性的海洋医用胶原蛋白。


2.根据权利要求1所述的低免疫原性的海洋医用胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的碱溶液、所述步骤（3）中的过氧化氢溶液进行2~8℃预冷；所述步骤（4）的搅拌温度、所述步骤（5）的盐析温度为2~8℃。

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【专利技术属性】
技术研发人员：刘楚怡，李八方，王园园，代元坤，宋文山，杜芬，
申请(专利权)人：青岛海洋生物医药研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37