一种SLC25A13基因突变位点检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开一种SLC25A13基因突变位点检测试剂盒及方法。所述试剂盒主要成分为PCR扩增引物SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:28和质谱延伸引物SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:43。通过使用本发明专利技术试剂盒，能够一次性同时准确检测出SLC25A13基因15个突变位点，具有高效、高通量、低成本、自动化的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种SLC25A13基因突变位点检测试剂盒及方法
本专利技术属于生物
，涉及一种检测SLC25A13基因位点突变试剂盒及检测方法，是一种基于MassARRAY质谱平台的SLC25A13基因突变型检测方法。
技术介绍
希特林蛋白缺乏症(Citrindeficiency)是由SLC25A13基因突变引起的Citrin转运体功能障碍的一种常染色体隐性遗传疾病。本病发病时期从新生儿到成人年龄不一，根据发病年龄不同，临床表现不同，早期发病多表现为肝内胆汁淤积(NICCD)，脂肪肝，成人期发病(CTLN2)多为高氨血症、脂肪肝或合并胰腺炎、肝细胞癌等，同时不同发病期都伴有不同程度的高氨血症和高瓜氨酸血症，临床上容易与其他肝病、胆汁淤积性肝炎、氨基酸代谢疾病等混乱。目前，我国采用串联质谱技术(MS-MS)测定新生儿末梢血中瓜氨酸浓度来对该病进行早期筛查。但据研究报道，仅40-50％的NICCD患者通过新生儿串联质谱筛查最终确诊，大多数患者出现黄疸、发育迟缓等症状后才就医确诊，原因可能为部分患者瓜氨酸迟发升高，新生儿串联筛查结果阴性，导致该疾病漏筛率较高。有研究采用分子检测技术对SLC25A13基因3个热点突变进行该疾病新生儿筛查，检出率虽有所提高但仍远低于发病率。在临床实践中随着NICCD患者数的不断增加，该病日益得到临床医生的重视。因此，急需提高NICCD新生儿筛查的敏感性。国内外正式报道的SLC25A13突变类型超过60余种，我国人群突变频率最高主要为c.851_854del4bp、IVS16ins3kb、c.1638_1660dup、IVS6+5G>A、c.1399C>T，总体大约占NICCD患者的85％以上。该基因突变在我国患者中高度的集中性，突变热点明确，有利于进行早期新生儿基因筛查。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种SLC25A13基因突变位点检测试剂盒，是一种基于MassARRAY质谱平台的SLC25A13基因突变检测试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，由PCR扩增引物和质谱延伸引物，10×PCR反应缓冲液、dNTPMix(25mM)、MgCl2(25mM)、PCR反应Taq酶、SAP反应缓冲液、SAP酶、iPlex反应缓冲液、iPlexTerminationMix、Extension反应Taq酶、MassARRAY芯片组成。其中：PCR扩增引物序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:28所示，质谱延伸引物序列如SEQIDNO:29～SEQIDNO:43中所示。所述的PCR扩增引物为包含序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:28所示的1管扩增引物的混合物，所述的PCR延伸引物为包含序列如SEQIDNO:29～SEQIDNO:43中所示的1管延伸引物的混合物。本专利技术的另一目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测SLC25A13基因突变试剂盒的使用方法，通过以下步骤实现：(1)设计如SEQIDNO:1～SEQIDNO:28所示的扩增引物和如SEQIDNO:29～SEQIDNO:43所示的延伸引物；(a)PCR扩增引物：PCR扩增引物为根据SLC25A13基因设计的特异性针对15个热点突变位点的扩增引物，所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列。本专利技术的扩增引物选自SEQIDNO:1～SEQIDNO:28中；优选地，本专利技术的扩增引物包括SEQIDNO:1～SEQIDNO:28；最优选地，本专利技术的扩增引物由SEQIDNO:1～SEQIDNO:28组成。(b)延伸引物：延伸引物的长度为15-26个碱基并且其3’端位于突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为SLC25A13基因热点突变位点。本专利技术的延伸引物选自SEQIDNO:29～SEQIDNO:43中，优选地，本专利技术的延伸引物包括SEQIDNO:29～SEQIDNO:43；最优选地，本专利技术的延伸引物由SEQIDNO:29～SEQIDNO:43组成。(2)将SEQIDNO:1～SEQIDNO:28所示的扩增引物混合得到1管扩增引物混合液，将SEQIDNO:29～SEQIDNO:43所示的延伸引物混合得到1管延伸引物混合液；(3)检测模板的制备：提取待测样本DNA；(4)以步骤(3)中提取的DNA为模板，利用步骤(1)中的扩增引物进行PCR扩增，获得靶序列的PCR产物；(5)SAP酶处理，除去步骤(4)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP；(6)以步骤(5)中获得的扩增产物为模板，使用步骤(2)中的延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物；(7)采用树脂纯化步骤(6)中获得的延伸产物；(8)采用飞行时间质谱基因分型系统对纯化产物进行扫描、检测，检测结果使用TYPER4.0软件分型并输出结果，通过质谱峰变异碱基处是否出峰来判断是否突变。本专利技术试剂盒能一次性检测15种常见的SLC25A13突变类型，基于Massarry平台的检测方法简便，准确率高，同时还具有高通量、低成本、自动化等特点。附图说明图1表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为7383.9Da的T峰位置，此数据表明该样本为纯合T，为IVS16ins3kb野生纯合型样本的质谱峰图结果。图2表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为7383.9Da的T峰和7399.9Da的C峰，此数据表明该样本为杂合，为IVS16ins3kb杂合型样本的质谱峰图结果。图3表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5423.4Da的峰位置，此数据表明该样本为纯合，为c.852_855del野生型纯合型样本的质谱峰图结果。图4表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5367.5Da的del峰位置，此数据表明该样本为纯合，为c.852_855del突变纯合型样本的质谱峰图结果。图5表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为5367.5Da的del峰和5423.4Da的峰位置，此数据表明该样本为杂合，为c.852_855del杂合型样本的质谱峰图结果。图6表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6425.2Da的G峰位置，此数据表明该样本为纯合G，为野生纯合型样本的质谱峰图结果。图7表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6425.2Da的G峰和6409.2Da的A峰位置，此数据表明该样本为杂合，为c.1177+1G>A杂合型样本的质谱峰图结果。图8表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6780.5Da的G峰位置，此数据表明该样本为纯合G，为野生纯合型样本的质谱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测SLC25A13基因位点突变试剂盒，其特征在于：由PCR扩增引物和质谱延伸引物，10×PCR反应缓冲液、dNTP Mix(25mM)、MgCl

【技术特征摘要】
1.一种检测SLC25A13基因位点突变试剂盒，其特征在于：由PCR扩增引物和质谱延伸引物，10×PCR反应缓冲液、dNTPMix(25mM)、MgCl2(25mM)、PCR反应Taq酶、SAP反应缓冲液、SAP酶、iPlex反应缓冲液、iPlexTerminationMix、Extension反应Taq酶、MassARRAY芯片组成。其中：PCR扩增引物序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:28所示，质谱延伸引物序列如SEQIDNO:29～SEQIDNO:43中所示。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的PCR扩增引物为包含扩增引物的混合物，扩增引物序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:28所示；所述的PCR延伸引物为包含延伸引物的混合物，延伸引物序列如SEQIDNO:29～SEQIDNO:43中所示。


3.权利要求1所述的一种检测SLC25A13基因突变试剂盒的使用方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄新文，朱琳，胡真真，蒋梦怡，周朵，胡凌薇，张超，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33