一种体外培育熊胆粉中卡那霉素的测定方法技术

本发明专利技术提供了一种体外培育熊胆粉中卡那霉素的测定方法，其包括：称取体外培育熊胆粉样品水中，然后振荡至样品完全溶解；将前述处理得到的溶液上样于活化的混合型弱阳离子交换反向固相萃取柱，弃去上样液，冲洗，洗脱，收集洗脱液至塑料容器中，用20％甲酸乙腈稀释至刻度，滤过，取续滤液，得到供试品溶液，注入液相色谱‑质谱仪进行检测；其中液相色谱以酰胺基键合硅胶为填充剂，流动相包括甲酸溶液和甲酸乙腈溶液，流速为0.2～0.6ml/min。该方法具有中间精密度良好、准确度高、重复性良好的优点，此外，浓度为9.1535ng/ml的供试品溶液作为该方法检出限，方法检出限为0.09mg/kg，因此为体外培育熊胆粉中卡那霉素残留量的检测提供了可靠易操作的方法，促进了对其的安全性把控。

【技术实现步骤摘要】
一种体外培育熊胆粉中卡那霉素的测定方法
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种体外培育熊胆粉中卡那霉素的测定方法。
技术介绍
公知的熊胆粉，是从黑熊、棕熊的干燥胆或黑熊引流之胆汁干燥后获得，其主要成份有：牛磺熊去氧胆酸钠；胆色素(胆红素和胆绿素)以及胆汁酸(主要是结合型鹅去氧胆酸和结合型胆酸)。熊胆是四大名贵动物药之一，有2000余年的入药历史，有大量的处方都含有熊胆成分。熊胆内服主治小儿热盛惊风、癫痫、抽搐、黄疸等，外用可治疗痈肿、痔疮、目赤云翳等。但熊在自然界中的数量却十分有限，仅靠生物熊胆粉远远满足不了市场的需求。申请号为201410588581.5的现有专利公开了一种人工熊胆粉及其制备方法，具体生产了一种体外培育(生物转化)熊胆粉，其以禽类胆粉为原料，通过体外模拟胆汁酸肝肠循环，采用两步酶促法与双酶联用循环转化技术对禽胆粉进行生物转化获得，其原料来源广泛易得，不需要再添加其他化学物质，可以促进熊胆产业健康发展。但上述体外培育熊胆粉制备过程所需的关键酶菌体--A酶菌体和B酶菌体是通过7α-HSDH和7β-HSDH两个重组质粒转化到宿主菌E.coliBL21(DE3)中，经抗性筛选并通过多级培养后获得的。其中，卡那霉素是A酶菌体/B酶菌体一级发酵和二级发酵过程中用到的抗生素。为加强对体外培育(生物转化)熊胆粉的安全性把控，需对发酵过程中的主要添加物，特别是对卡那霉素进行含量限度检查，但目前未有检测体外培育熊胆粉中卡那霉素残留量的方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种体外培育熊胆粉中卡那霉素的测定方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种体外培育熊胆粉中卡那霉素的测定方法，包括如下步骤：步骤一，溶解样品：称取体外培育熊胆粉样品水中，然后振荡8～15分钟至样品完全溶解；步骤二，净化处理：将步骤一处理得到的溶液上样于活化的混合型弱阳离子交换反向固相萃取柱，弃去上样液，冲洗，洗脱，收集洗脱液至塑料容器中，用20％甲酸乙腈稀释至刻度，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；步骤三，将上述供试品溶液注入液相色谱-质谱仪进行检测；其中液相色谱以酰胺基键合硅胶为填充剂，流动相包括甲酸溶液和甲酸乙腈溶液，流速为0.2～0.6ml/min。进一步地，上述方法还包括对照品溶液的配制，采用的溶剂为10％甲酸溶液。进一步地，步骤一中体外培育熊胆粉样品与水的比例为50～200mg/5ml。进一步地，步骤二中的混合型弱阳离子交换反向固相萃取柱为WatersOasisWCX固相萃取柱，其规格500mg/6cc。进一步地，上述混合型弱阳离子交换反向固相萃取柱采用甲醇和水对上述亲水亲脂平衡固相萃取柱进行活化；甲醇和水的体积比为1:1。进一步地，上述测定方法中采用的器皿均为聚四氟乙烯材质。进一步地，步骤二中依次采用等体积的水和甲醇进行冲洗，采用20％甲酸乙腈溶液进行洗脱。进一步地，步骤三中采用的色谱柱为WatersACQUITYUPLCBEHAmide，其规格为100mm×3.0mm，1.7μm；以0.2％甲酸溶液为流动相A，0.2％甲酸乙腈溶液为流动相B；流速为0.4mL/min，柱温为40℃；采用的梯度洗脱程序如下：进一步地，步骤三中质谱检测的条件为：采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)负离子模式下多反应监测(MRM)；多反应监测的离子对如下：本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：本专利技术提供的体外培育熊胆粉中卡那霉素的测定方法通过对净化、检测步骤中的萃取柱的选取、标准品的制备、液相色谱-质谱的参数等进行优选，具有中间精密度良好、准确度高、重复性良好的优点，此外，浓度为9.1535ng/ml的供试品溶液作为该方法检出限，方法检出限为0.09mg/kg，因此为体外培育熊胆粉中卡那霉素残留量的检测提供了可靠易操作的方法，促进了对体外培育(生物转化)熊胆粉的安全性把控。附图说明图1为卡那霉素的MRM色谱图。具体实施方式针对申请号为201410588581.5的现有专利中的人工熊胆粉，本专利技术提供了一种体外培育熊胆粉中卡那霉素的测定方法，包括如下步骤：步骤一，溶解样品：称取体外培育熊胆粉样品水中，然后振荡8～15分钟至样品完全溶解；步骤二，净化处理：将步骤一处理得到的溶液上样于活化的混合型弱阳离子交换反向固相萃取柱，弃去上样液，冲洗，洗脱，收集洗脱液至塑料容器中，用20％甲酸乙腈稀释至刻度，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；步骤三，将上述供试品溶液注入液相色谱-质谱仪进行检测；其中液相色谱以酰胺基键合硅胶为填充剂，流动相包括甲酸溶液和甲酸乙腈溶液，流速为0.2～0.6ml/min。在本专利技术一优选的实施方式中，上述方法还包括对照品溶液的配制，采用的溶剂为10％甲酸溶液。在本专利技术一优选的实施方式中，步骤一中体外培育熊胆粉样品与水的比例为50～200mg/5ml；优选为100mg/5ml。在本专利技术一优选的实施方式中，步骤二中的混合型弱阳离子交换反向固相萃取柱为WatersOasisWCX固相萃取柱，其规格500mg/6cc。在本专利技术一优选的实施方式中，上述混合型弱阳离子交换反向固相萃取柱采用甲醇和水对上述亲水亲脂平衡固相萃取柱进行活化；甲醇和水的体积比为1:1；优选依次采用4ml甲醇、4ml水对上述亲水亲脂平衡固相萃取柱进行活化。在本专利技术一优选的实施方式中，上述测定方法采用的器皿均为聚四氟乙烯材质。在本专利技术一优选的实施方式中，步骤二中依次采用等体积的水和甲醇进行冲洗，采用20％甲酸乙腈溶液进行洗脱。在本专利技术一优选的实施方式中，步骤三中采用的色谱柱为WatersACQUITYUPLCBEHAmide，其规格为100mm×3.0mm，1.7μm；以0.2％甲酸溶液为流动相A，0.2％甲酸乙腈溶液为流动相B；流速为0.4mL/min，柱温为40℃；采用的梯度洗脱程序如下表1：表1梯度洗脱的程序在本专利技术一优选的实施方式中，步骤三中质谱检测的条件为：采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)负离子模式下多反应监测(MRM)；多反应监测的离子对如下表2：表2多反应监测的离子对下面通过具体实施例对本专利技术进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本专利技术，但是下述实施例并不限制本专利技术范围。实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。实施例1本实施例对体外培育熊胆粉中卡那霉素的测定方法中的条件和参数进行探究，具体的策略如下：1.对照品溶液制备1.1溶剂的选择最初用20％乙腈溶液配制标曲，发现卡那霉素在较低浓度(100ng/ml以下)发生不同程度的降解，导致化合物在配制浓度范围内不成线性，呈二次函数本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外培育熊胆粉中卡那霉素的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一，溶解样品：称取体外培育熊胆粉样品水中，然后振荡8～15分钟至样品完全溶解；/n步骤二，净化处理：将步骤一处理得到的溶液上样于活化的混合型弱阳离子交换反向固相萃取柱，弃去上样液，冲洗，洗脱，收集洗脱液至塑料容器中，用20％甲酸乙腈稀释至刻度，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；/n步骤三，将所述供试品溶液注入液相色谱-质谱仪进行检测；其中液相色谱以酰胺基键合硅胶为填充剂，流动相包括甲酸溶液和甲酸乙腈溶液，流速为0.2～0.6ml/min。/n

【技术特征摘要】
1.一种体外培育熊胆粉中卡那霉素的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，溶解样品：称取体外培育熊胆粉样品水中，然后振荡8～15分钟至样品完全溶解；
步骤二，净化处理：将步骤一处理得到的溶液上样于活化的混合型弱阳离子交换反向固相萃取柱，弃去上样液，冲洗，洗脱，收集洗脱液至塑料容器中，用20％甲酸乙腈稀释至刻度，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；
步骤三，将所述供试品溶液注入液相色谱-质谱仪进行检测；其中液相色谱以酰胺基键合硅胶为填充剂，流动相包括甲酸溶液和甲酸乙腈溶液，流速为0.2～0.6ml/min。


2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法还包括对照品溶液的配制，采用的溶剂为10％甲酸溶液。


3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤一中所述体外培育熊胆粉样品与水的比例为50～200mg/5ml。


4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤二中所述混合型弱阳离子交换反向固相萃取柱为WatersOasisWCX固相萃取柱，其规格500mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：季申，胡青，毛秀红，孙健，周恒，冯睿，王帆，张小利，
申请(专利权)人：上海凯宝药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31