一种用于预测低果糖桃的SNP分子标记及检测方法技术

本发明专利技术提供一种通过SNP分子标记预测桃果糖含量水平的方法，所述标记位点桃1号染色体11,910,990bp位点的碱基。当其为GG基因型时，则待检桃品种所结果实为100％低果糖；该位点为CG时，则待检桃品种所结果实约90.9％可能性为低果糖；该位点为CC时，则待检桃品种所结果实约9.8％可能性为低果糖。本发明专利技术的方法可用于桃果糖的早期预测，杂交亲本的选择和品种资源的鉴定，可用于有目的的桃品种的选育，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于预测低果糖桃的SNP分子标记及检测方法
本专利技术涉及植物分子生物学，生物信息学和植物分子育种领域，具体涉及与用于预测低果糖桃的SNP分子标记及检测方法。
技术介绍
桃是多年生木本植物，广泛生长于亚热带地区，是重要的经济果树之一。我国是世界第一大产桃国，根据世界粮农组织(FAOSTAT)最新统计数据，2019年我国桃总产量为1584.2万吨，占世界总产量的61.55％。含糖量是影响果实品质的主要因素之一。其次，糖组分比例不同也影响着果实的甜味口感。果糖的甜度是蔗糖的1.7倍，是所有天然糖中甜度最高的糖之一(Kroger,M.,Meister,K.,&Kava,R.Low-caloriesweetenersandothersugarsubstitutes:areviewofthesafetyissues.Comp.Rev.FoodSci.F.5,35–47(2006))。相比于其他糖类物质，果糖的特点是口感响应快，消失得也快，不会掩盖其他风味，能够与多种风味物质共存(罗雅君,李珂,赵琳&李宗军(2013),"果糖的利用现状及其与现代流行病的关系研究进展",农产品加工，No.20,pp.60-63)，因此提高果糖含量也是提升果实口感品质最为有效的一种手段。桃果实中的主要糖组分是蔗糖，其次是葡萄糖和果糖(Cirilli,M.,Bassi,D.,&Ciacciulli,A.Sugarsinpeachfruit:abreedingperspective.Hort.Res.3,1–12(2016))。然而，在比较地方品种与现代栽培种群体时发现，在主要糖组分中，仅果糖在两个群体中具有显著差异，说明在桃改良过程中，果实甜味口感品质的提升主要是通过提高果糖含量来实现的。果实糖含量性状大多为数量性状，受多基因调控，桃果糖性状同样如此，根据已有的文献报道，在1、3、4、5、6、7、8号连锁群上均发现了果糖连锁QTL(Quilot,B.etal.QTLanalysisofqualitytraitsinanadvancedbackcrossbetweenPrunuspersicacultivarsandthewildrelativespeciesP.davidiana.Theor.Appl.Genet.109,884–897(2004)；陈昌文,张佳卉,曹珂,朱更瑞,方伟超,王新卫&王力荣(2015)),"桃地方品种果实糖酸主要组分的遗传关联分析",果树学报,No.06,pp.1036-1046；李雄伟,贾惠娟&高中山(2013),"桃基因组及全基因组关/联分析研究进展",遗传,Vol.35No.10,pp.1167-1178.)。但是，由于所选用的研究群体不同，并且该性状与果树生长环境关系密切，受光照、雨水、种植技术等因素影响较大，因此这些位点大多缺乏可重复性，并且标记效应不高，很难在育种中得到实际应用。到目前为止，仍缺乏有效的技术手段能在幼苗阶段对桃果实甜味口感进行准确预测，而甜味品质又是果实最重要的育种目标之一，因此开发能准确预测这些复杂性状的分子标记，将有助于实现高效分子辅助育种的现实目标，符合当下经济作物优质发展与产业提质增效的科技发展方向。
技术实现思路
本专利技术的目的在于预测低果糖桃以用于桃的育种，因而提供一个与桃果糖含量相关的SNP分子标记及其在分子育种中的应用。为实现该目的，本专利技术提供了一种与桃果糖含量相关的SNP分子标记，所述分子标记是桃1号染色体11,910,990bp位点的碱基。当其为GG基因型时，则待检桃品种所结果实为100％低果糖；该位点为CG时，则待检桃品种所结果实约90.9％可能性为低果糖；该位点为CC时，则待检桃品种所结果实约9.8％可能性为低果糖。其中低果糖的标准并非果糖水平的绝对值，而是基于一个涵盖了源于中国、欧美、日本等主要桃产区中代表性种质资源的相对果糖含量水平。即同一气候环境条件下，测量上述种质资源的果糖含量，以所获取数据的最小值为基点，以(最大值-最小值)/10为步长，将待测样品按果糖含量高低划分成1-10级。其中1-2级为低果糖，3-5级为中果糖，6-10级为高果糖。本专利技术还提供了一种利用上述分子标记以通过SNP分子标记预测桃果糖含量的方法。采用PCR扩增和测序来检测待测桃基因组中1号染色体11,910,990bp位点的碱基。当其为GG基因型时，则待检桃品种所结果实预测为低果糖；该位点为CG时，则待检桃品种所结果实预测为低果糖；该位点为CC时，则待检桃品种所结果实预测不为低果糖。从育种角度，在杂交后代筛选方面，如果目标是低果糖，则应优选杂交后代该位点为GG或CG型的优株；如果目标是高果糖，则应选择该位点是CC型的优株。在配置杂交组合的亲本选择方面，根据育种目标选择亲本是高果糖基因型CC，或是低果糖基因型GG，或者杂合型CG，需要说明的是，该位点低果糖相对于高果糖来说为显性表型，即CG型的果实表型为低果糖。在另一个实施方式中，采用KASP技术来检测待测桃基因组中1号染色体11,910,990bp位点的碱基。优选的根据该位点及其前后50bp序列(SEQIDNO：1或SEQIDNO：2)来设计KASP引物组合，具体包括上游两条正向引物，优选分别连接VIC(P1)和FAM(P2)荧光标记，下游一条反向引物为第P3引物：P1：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGTGGTATATCACATTCTAGGTTTATTC(SEQIDNO：3)P2：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTGGTATATCACATTCTAGGTTTATTG(SEQIDNO：4)P3：GGTAAGTCTCTAGTTTGACTGAGTTGC(SEQIDNO：5)。具体地，每条引物用无菌水溶解并稀释至100μM，按照P1：P2：P3：水＝24：24：48：100比例混合备用。进行检测时所用的PCR反应体系如下：名称384孔板(4μL体系)2xTaqDNA聚合酶Mix2μLSNP引物混合(4x)1μLDNA样品(20ng/μL)1μLPCR扩增体系：SNP位点检测使用一组包括两个温度步骤的热循环条件，而不是传统的三个步骤。在该方案中，DNA在较高的温度下变性，然后在一个较低的相同温度退火和延伸。具体PCR热循环条件下表所示。PCR热循环扩增可在任何合适的PCR基因扩增仪上进行。所述用PCR反应参数为：94℃10min，然后94℃20sec、61-55℃60sec循环10次，每个循环下降0.6℃，再于94℃20sec、55℃60sec循环27次。如下表所示：根据所述荧光信号判断各个位点的基因型：PCR扩增循环结束后，在低于40℃的环境下，利用荧光定量PCR仪器读取荧光值。在本方法中，SNP位点检测使用荧光团FAM和VIC来区分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种桃果糖含量低水平相关的SNP分子标记，其特征在于：所述分子SNP标记来自桃基因组1号染色体11,910,990bp位点，其为GG基因型或CG基因型时。/n

【技术特征摘要】
1.一种桃果糖含量低水平相关的SNP分子标记，其特征在于：所述分子SNP标记来自桃基因组1号染色体11,910,990bp位点，其为GG基因型或CG基因型时。


2.一种通过SNP分子标记预测桃果糖含量水平的方法，其特征在于：所述分子SNP标记来自桃基因组1号染色体11,910,990bp位点，通过确定其为GG基因型或CG基因型时，则桃果糖含量水平为低果糖；当其为CC基因型时，则桃果糖含量水平不为低果糖。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述方法用于桃果糖的早期预测，或者杂交亲本的选择。


4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，采用PCR扩增和测序列来检测待测桃基因组中1号染色体11,910,990bp位点的基因型。


5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用KASP检测待测桃基因组中1号染色体11,910,990bp位点的基因型。


6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，KASP引物组合，包括上游两条正向引物，以及下游一条反向引物为P3引物，其中各引物序列如下：
P1：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGTGGTATATCACATTCTAGGTTTATTC；
P2：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTGGTATATCACATTCTAGGTTTATTG；
P3：GGTAAGTCTCTAGTTTGACTGAGTTGC；；
优选地，P1引物连接荧光标记VIC和P2引物连接荧光标记FAM。


7.如权利要求6所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐摇光，谢华，于洋，官健涛，
申请(专利权)人：北京农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11