BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法及其用途技术

本发明专利技术属于核酸检测技术领域，公开了一种BCR‑ABL1突变基因T315I的荧光检测方法及其用途，BCR‑ABL1突变基因T315I的荧光检测方法包括：环状DNA模板的制备；DNAzyme特异性识别剪切反应；T4PNK特异性修饰；滚环扩增反应介导信号放大。本发明专利技术通过脱氧核酶DNAzymes特异性识别剪切、T4多核苷酸激酶T4PNK特异性修饰、滚环扩增反应RCA介导信号放大，成功构建了可用于T315I mRNA特异性检测的荧光方法，应用本发明专利技术策略对T315IRNA的测定，灵敏度高，重现性和稳定性好，能够满足早期临床诊断治疗、指导用药的要求，实现T315I突变基因的准确、快速检测。

【技术实现步骤摘要】
BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法及其用途
本专利技术属于核酸检测
，尤其涉及一种BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法及其用途。
技术介绍
目前，慢性粒细胞白血病(Chronicmyeloidleukemia，CML)是一种影响血液及骨髓的恶性肿瘤，大约95％的CML患者会出现9号染色体和22号染色体长臂之间的染色体易位，即t(9；22)(q34；q11)产生的费城染色体(Ph)。染色体易位的结果是基因重新组合形成特异性的BCR-ABL融合基因，导致下游一系列信号通路过度活化表达，引起细胞恶性增殖。选择性的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibition，TKI)是治疗CML的重要手段，但是，ABL激酶结构域发生突变或其他原因会导致肿瘤耐药。其中，T315I突变是最重要的突变之一，一旦出现T315I突变，患者对现有的一、二代TKIs均耐药，预后极差。因此，尽早检出T315I突变对指导CML患者下一步用药及治疗，改善预后具有重要意义。目前，基于聚合酶链式反应(Ranscrip本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种BCR-ABL1突变基因T315I在慢性粒细胞白血病检测中的用途。/n

【技术特征摘要】
1.一种BCR-ABL1突变基因T315I在慢性粒细胞白血病检测中的用途。


2.一种BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，所述BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法包括：
(1)在均相反应体系中，当T315I基因存在时，用连接DNAzyme的两个部分酶片段，在Mg2+存在的条件下，激活DNAzyme的剪切活性，将T315I基因剪切为两段裂解产物f1和f2，并在f1和f2的剪切位点分别产生3’端2’3’-环磷酸二酯末端和5’端羟基末端；
(2)利用T4PNK酶进行修饰，切除f1的2’3’-环磷酸二酯末端并引入3’-OH末端，经T4PNK修饰过的f1命名为f1’；
(3)反应过后，f1’片段可以当作引物，引发滚环扩增反应；在phi29DNA聚合酶的作用下，RCA反应产生大量含重复序列的单链DNA；
(4)RCA产生的单链DNA与体系中存在的拉链探针发生链置换反应，单链DNA与携带荧光基团的D-oligo完全互补，置换出游离C-oligo，导致荧光信号的产生，通过检测荧光信号强度即可获知T315I基因的量。


3.如权利要求2所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，所述BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法包括以下步骤：
步骤一，环状DNA模板的制备；
步骤二，DNAzyme特异性识别剪切反应；
步骤三，T4PNK特异性修饰；
步骤四，滚环扩增反应介导信号放大。


4.如权利要求3所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，步骤一中，所述环状DNA模板的制备，包括：
(1)将浓度为2μM的5’端磷酸化后的线性DNA模板Cir-DNA和浓度为6μM的连接模板Ligation混合于1×T4DNA连接缓冲液中，加热至90℃反应5min，随后缓慢冷却至室温，使Cir-DNA和Ligation之间进行杂交反应；
(2)向反应液中加入3.5U/μL的T4DNA连接酶，充分混匀，于16℃孵育16h完成连接反应；反应后温度升至65℃保持10min，使连接酶失去活性；
(3)向反应产物中加入0.25U/μL的ExoI和5U/μL的ExoIII，于37℃孵育5h以消化未成环的单链DNA或非特异性杂交的双链DNA，反应结束后温度升至80℃孵育20min使外切酶失去活性；
(4)反应结束后，环状DNA模板制备完成，4℃下可保存1月。

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【专利技术属性】
技术研发人员：周晓燕，刁玮，玄超，张昀源，郑红英，孙异凡，
申请(专利权)人：青岛大学附属医院，
类型：发明
国别省市：山东;37