高通量全兔源单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术涉及动物免疫，基因工程，抗体工程及自动化设备技术领域，尤其涉及高通量全兔源单克隆抗体的制备方法。提供的方案包括免疫、分选、扩增、重组、表达几个步骤，完全摒弃了利用传统杂交瘤技术和B细胞培养技术来获取兔单克隆抗体，无需进行细胞培养，通过直接克隆抗体VH&VL，并构建至表达载体上实现兔单克隆抗体发现的技术，将兔单克隆抗体开发时间从8‑12周才能确定的完成整抗体序列，缩短至3周时间。并完全解决了杂交瘤技术和B细胞培养技术过程中，细胞凋亡和不稳定性等问题。

【技术实现步骤摘要】
高通量全兔源单克隆抗体的制备方法
本专利技术涉及动物免疫，基因工程，抗体工程及自动化设备
，尤其涉及高通量全兔源单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
兔单克隆抗体是新一代单克隆抗体应用于科研、诊断和治疗。与小鼠单克隆抗体相比，兔单克隆抗体由于其独特免疫机制和抗体基因类型，具有更高亲和力，更强的特异性，广谱的抗原识别位点和易于人源化等特点，是近年来复合增长率最快的一物种抗体，已经迅速成为诊断和治疗各种传染性疾病，自身免疫病与肿瘤等人类疾病的重要工具。目前，越来越多的公司通过用高质量兔单克隆抗体来替换多抗或低亲合力鼠单克隆抗体产品，来改进难以复制的诊断和治疗产品。目前兔单克隆抗体发现的主要技术方案包括：兔杂交瘤技术，噬菌体展示技术，兔B细胞培养技术。兔杂交瘤技术芝是加哥Loyola大学的KatherineKnight教授在九十年代中期制备了第一株兔源的杂交瘤，可以分泌兔的单克隆抗体，然而第一代融合细胞株(240E-1)极不稳定且产量低。RobertPytela和朱伟民等在Knight教授研究的基础上继续探索，最后非常幸运地获得了唯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高通量全兔源单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：/n步骤1：抗原免疫兔子后取外周血分离单个核细胞、脾细胞和肠系淋巴结细胞；/n步骤2：流式细胞术分选抗原特异性B淋巴细胞；/n步骤3：扩增所述抗原特异性B淋巴细胞的可变区；/n步骤4：所述可变区经重组、表达获得兔源单克隆抗体；/n所述流式细胞术分选的标志物选自如下I～IV中任一种组合：/nI)、7AAD、CD4、CD8、CD14、IgM、IgG、抗原；/nII)、7AAD、CD4、CD8、CD11b、IgM、IgG、抗原；/nIII)、7AAD、T Lymphocytes、CD11b、IgM、IgG、抗原；/nIV)、7AAD、T Lym...

【技术特征摘要】
1.高通量全兔源单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1：抗原免疫兔子后取外周血分离单个核细胞、脾细胞和肠系淋巴结细胞；
步骤2：流式细胞术分选抗原特异性B淋巴细胞；
步骤3：扩增所述抗原特异性B淋巴细胞的可变区；
步骤4：所述可变区经重组、表达获得兔源单克隆抗体；
所述流式细胞术分选的标志物选自如下I～IV中任一种组合：
I)、7AAD、CD4、CD8、CD14、IgM、IgG、抗原；
II)、7AAD、CD4、CD8、CD11b、IgM、IgG、抗原；
III)、7AAD、TLymphocytes、CD11b、IgM、IgG、抗原；
IV)、7AAD、TLymphocytes、CD14、IgM、IgG、抗原。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中：
所述免疫的抗原为蛋白、多肽、小分子化合物或核酸；
所述兔子为雌性新西兰兔；
所述免疫为间隔两周免疫，免疫6～9次。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，以标志物组合II)或III)，分选脾细胞中的抗原特异性B淋巴细胞。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述扩增包括反转录、第一轮巢式PCR扩增和第二轮巢式PCR扩增；
所述第一轮巢式PCR的正向引物在IgG先导肽区域，反向引物位于IgGCH1区域；
所述第二轮巢式PCR获得重链可变区扩增产物、轻链λ可变区扩增产物和轻链κ可变区扩增产物。


5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一轮巢式PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢亚南，赵晰，
申请(专利权)人：上海儒克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31