针对CD19和CD3的同源二聚体型双特异性抗体及其制备方法和用途技术

提供了一种同时靶向免疫效应细胞抗原CD3和肿瘤相关抗原CD19的四价、同源二聚体型双特异性抗体分子，所述双特异性抗体分子从N端至C端依次包含第一和第二单链Fv和Fc片段；其中，第一单链Fv能够特异性结合CD19，第二单链Fv能够特异性结合CD3，且第一和第二单链Fv通过连接肽相连，而第二单链Fv与Fc片段直接相连或通过连接肽相连；所述Fc片段不具有CDC、ADCC和ADCP等效应子功能。所述双特异性抗体能够显著抑制或杀伤肿瘤细胞，又具有控制的可能由效应细胞过度活化所致的毒副作用；此外，这种双特异性抗体为同源二聚体型，不存在重链及轻链错配问题，纯化步骤简单高效，表达量高、且其理化和体内稳定性都显著提高。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对CD19和CD3的同源二聚体型双特异性抗体及其制备方法和用途相关申请本申请要求2018年11月1日提交的中国专利申请CN201811294887.4的优先权。以上所引用的优先权申请的内容全文以引用的方式并入本文。
本专利技术涉及免疫学领域，更具体地，涉及一种介导T细胞杀伤的抗CD3双特异性抗体，以及这类抗体的用途，特别是其在治疗癌症、自身免疫、炎症性疾病以及免疫排异中的用途。
技术介绍
机体通过固有免疫和适应性免疫排除异己以维持内环境稳定，而适应性免疫通过淋巴细胞B细胞和T细胞来执行其免疫功能。B淋巴细胞的作用之一是通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)直接杀伤靶细胞。B细胞表面的许多膜分子，如mIg，CD79a/CD79b，BCR(B细胞受体)，CD19，CD40等在B细胞识别抗原、活化、增殖以及分泌抗体等过程中发挥重要作用。BCR尤其是B细胞抗原特异性激活所必须的，其快速激活一系列激酶并启动一个复杂“信号体”的形成，继而激活下游诸如控制B细胞生长、存活和分化等途径。因此，BCR信号的稳态失衡及B细胞的异常活化可能导致相关疾本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双特异性抗体，所述双特异性抗体分子由两条相同的多肽链以共价键结合形成四价同源二聚体，每条多肽链从N端至C端依次包含特异性结合肿瘤相关抗原CD19的第一单链Fv、特异性结合效应细胞抗原CD3的第二单链Fv和Fc片段；其中，第一和第二单链Fv通过连接肽相连，而第二单链Fv与Fc片段直接相连或通过连接肽相连，且所述Fc片段不具有CDC、ADCC和ADCP等效应子功能。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181101 CN 2018112948874一种双特异性抗体，所述双特异性抗体分子由两条相同的多肽链以共价键结合形成四价同源二聚体，每条多肽链从N端至C端依次包含特异性结合肿瘤相关抗原CD19的第一单链Fv、特异性结合效应细胞抗原CD3的第二单链Fv和Fc片段；其中，第一和第二单链Fv通过连接肽相连，而第二单链Fv与Fc片段直接相连或通过连接肽相连，且所述Fc片段不具有CDC、ADCC和ADCP等效应子功能。


如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv所包含的VH结构域和VL结构域通过连接肽连接，且所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGX)n，X包含Ser或Ala，X优选Ser；n为1-5的自然数，n优选3。


如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述肿瘤相关抗原为CD19，包含但不限于：CD19的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物；优选地，CD19来源于人、食蟹猴或恒河猴。


如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合CD19，其包含的CDR1、CDR2和CDR3选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQIDNO：1、2和3所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQIDNO：4、5和6所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQIDNO：9、10和11所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQIDNO：12、13和14所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQIDNO：17、18和19所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQIDNO：20、13和21所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iv)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQIDNO：24、25和26所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQIDNO：27、28和29所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(v)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQIDNO：17、18和19所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQIDNO：32、33和21所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。


如权利要求1或4所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合CD19，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQIDNO：7所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQIDNO：8所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含如SEQIDNO：15所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQIDNO：16所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iii)VH结构域包含如SEQIDNO：22所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQIDNO：23所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iv)VH结构域包含如SEQIDNO：30所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQIDNO：31所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(v)VH结构域包含如SEQIDNO：34所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQIDNO：35所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(vi)VH结构域包含如SEQIDNO：36所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQIDNO：37所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(vii)VH结构域包含如SEQIDNO：38所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQIDNO：39所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。


一种能够特异性结合CD19的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含如权利要求4所述双特异性抗体第一单链Fv所包含的CDR1、CDR2和CDR3，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQIDNO：17、18和19所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQIDNO：32、33和21所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQIDNO：17、18和19所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQIDNO：20、13和21所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
优选地，所述单克隆抗体是人源化抗体；
优选地，所述抗原结合片段选自scFv、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)。


如权利要求6所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其所包含的VH结构域和VL结构域选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQIDNO：36所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQIDNO：37所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含如SEQIDNO：38所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQIDNO：39所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。


如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二单链Fv所包含的VH结构域和VL结构域通过连接肽连接，且所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGX)n，X包含Ser或Ala，X优选Ser；n为1-5的自然数，n优选3。


如权利要求1或8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二单链Fv在体外结合亲和力分析中以大于约10nM，或大于20nM，或大于40nM，或大于约50nM的EC
50值结合于效应细胞；更优选地，所述双特异性抗体的第二单链Fv不仅能与人CD3结合，还可与食蟹猴或恒河猴的CD3特异性结合。



如权利要求9所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQIDNO：40、41和42所示，或与上述序列至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQIDNO：43、44和45所示，或与上述序列至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代的序列。


如权利要求10所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含如SEQIDNO：46所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQIDNO：47所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。


如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述连接第一单链Fv和第二单链Fv的连接肽由柔性肽和刚性肽组成；且所述柔性肽包含2个或更多个氨基酸，并优选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)；更优地，所述柔性肽包含G和S残基；最优地，所述柔性肽的氨基酸组成结构通式为GxSy(GGGGS)z，其中x，y和z是大于或等于0的整数，且x+y+z≥1；所述刚性肽来自天然人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端第118至145位氨基酸组成的全长序列或其截短的片段；优选地，所述刚性肽包含SSSSKAPPPS。


如权利要求12所述的双特异性抗体，其特征在于，所述连接肽包含如SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：李强，贾世香，马心鲁，赵丽丽，崔雪原，张玉华，刘雪梅，张贵民，
申请(专利权)人：安源医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31