【技术实现步骤摘要】
一种酿酒酵母表达重组鱼硫氧还蛋白及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种酿酒酵母表达重组鱼硫氧还蛋白的制备方法。
技术介绍
硫氧还蛋白(Thioredoxin,TRX)是一类高度保守的低分子量蛋白质，在细胞内可溶性、对热稳定、具有氧化还原活性的酸性小分子蛋白质，分子量约为12kDa。硫氧还蛋白中存在两种结构类型，分别是硫氧还蛋白-1和硫氧还蛋白-2。第一种结构类型，主要存在于细胞质和细胞核中；而第二种结构类型，也就是硫氧还蛋白-2，只存在于线粒体中。TRX广泛分布于植物、细菌、酵母和动物中，它与硫氧还蛋白还原酶(TR)、还原型烟酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)三者共同组成硫氧还蛋白系统(TRX系统)，是一个有效的蛋白还原系统。TRX在其保守的活化区域内含有二硫巯基和二硫键，其氧化还原活性使硫氧还蛋白具有维持体内稳定的氧化还原状态、调节细胞生长、抑制凋亡、调节基因转录影响蛋白在动物体内的含量、免疫调节等功能。大黄鱼硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶的验证和功能鉴定(陈梦楠，浙江海洋大学)中指出：大黄鱼(...
【技术保护点】
1.一种酿酒酵母表达重组鱼硫氧还蛋白，其特征在于，重组鱼硫氧还蛋白氨基酸序列为序列表1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种酿酒酵母表达重组鱼硫氧还蛋白，其特征在于，重组鱼硫氧还蛋白氨基酸序列为序列表1所示。
2.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达重组鱼硫氧还蛋白，其特征在于，所述重组鱼硫氧还蛋白氨基酸序列，是根据鱼硫氧还蛋白氨基酸序列以及酿酒酵母对密码子的偏爱性人工设计获得。
3.一种酿酒酵母表达重组鱼硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-MFα-rFTRX-His的构建，具体包括：
鱼硫氧还蛋白基因的人工优化，以获得质粒pMD19-T-rFTRX-His；
对质粒pYES2/CT-MFα及以上胶回收的rFTRX-His片段进行双酶切，获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-rFTRX-His；
(2)pYES2/CT-MFα-rFTRX-His工程菌的制备、转化，具体包括：
酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制；
将步骤(1)获得的pYES2/CT-MFα-rFTRX-His以及pYES2/CT-MFα质粒分别转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养基的培养及PCR扩增、筛选，获得阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rFTRX-His)；
(3)含有pYES2/CT-MFα-rFTRX-His的酿酒酵母工程菌的摇瓶培养、诱导表达纯化及检定，具体包括：
将步骤(2)获得的阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rFTRX-His)，通过培养、离心、收集上清液经过柱层析，得纯化后的上清蛋白液，经SDS-PAGE电泳以及鼠抗His单克隆抗体经Westernblot鉴定，均可观察到特异性条带，即为本发明获得的酿酒酵母表达重组鱼硫氧还蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种酿酒酵母表达重组鱼硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，鱼硫氧还蛋白基因的人工优化，以获得质粒pMD19-T-rFTRX-His，具体步骤为：
根据鱼硫氧还蛋白氨基酸序列以及酿酒酵母对密码子的偏爱性，人工设计了酿酒酵母偏爱型鱼硫氧还蛋白基因，重组鱼硫氧还蛋白氨基酸序列为序列表1所示；
将重组鱼硫氧还蛋白基因以FTRX-His的顺序插入pMD19-TSimpleVector的HindⅢ酶切位点和XbaⅠ酶切位点之间，其5’端HindⅢ酶切位点，3’端接XbaⅠ酶切位点，由此得到质粒pMD19-T-rFTRX-His。
5.根据权利要求3所述的一种酿酒酵母表达重组鱼硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对质粒pYES2/CT-MFα及以上胶回收的rFTRX-His片段进行双酶切，获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-rFTRX-His，具体步骤为：
根据rFTRX-His基因的序列设计合成正向引物rFTRX-HisF和反向引物rFTRX-HisR，通过PCR扩增pMD19-T-rFTRX-His质粒中rFTRX-His基因，按照凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收；
用QuickCutNotI和QuickCutXbaI分别对购买...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，刘洁，徐文俊，夏兵兵，周炜，张勇，夏洁，
申请(专利权)人：芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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