一种分离纯化生物表面活性剂鼠李糖脂的方法技术

本发明专利技术公开了一种分离纯化生物表面活性剂鼠李糖脂的方法，所述方法为：将鼠李糖脂发酵液离心取上清液，加酸调节pH后再离心取沉淀，沉淀重悬洗涤后所得上清液再用酸调节pH然后离心取沉淀，用有机溶剂对沉淀进行萃取，最后用磷酸盐缓冲溶液进行反萃取得到纯化后的鼠李糖脂溶液。本发明专利技术在现有鼠李糖脂分离纯化方法的基础上进行改进，优化提取工艺，从而提高了鼠李糖脂的纯化浓度。

【技术实现步骤摘要】
一种分离纯化生物表面活性剂鼠李糖脂的方法
本专利技术属于分离纯化
，具体涉及一种分离纯化生物表面活性剂鼠李糖脂的方法。
技术介绍
鼠李糖脂主要是由铜绿假单胞菌菌株产生的一类生物表面活性剂，由一个或两个鼠李糖分子与一个或两个多羟基脂肪酸连接而成。目前已经有60多种不同结构的鼠李糖脂，可以根据鼠李糖基数目的不同将其分为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂。在鼠李糖脂发酵生产过程中，鼠李糖脂混合物的多样性(种类及其比例)取决于多种因素，如铜绿假单胞菌自身性质、碳源类型、培养条件、培养时间等。与化学表面活性剂相比，鼠李糖脂除了具有降低表面张力、乳化性、起泡性外，还具生物降解性、低毒性、可再生资源生产和抗菌(特别是抗真菌)活性等特点，这些特点使其具有广泛的商业应用前景，在环境保护、原油回收、日化、医疗保健和食品加工等领域显示出巨大的应用潜力，此外，鼠李糖脂也逐步应用于纳米粒子和微乳液的制备。目前，鼠李糖脂的分离纯化方法主要有萃取法、柱层析法、膜分离法等，鼠李糖脂是由疏油亲水的极性基团和疏水亲油的碳氢链组成的非极性基团组成。所以鼠李糖脂既具有亲水性又具有亲油性，能够溶于水和氯仿、乙醚、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂中，目前绝大部分实验室规模下使用萃取法分离纯化鼠李糖脂，而单纯的萃取法需要用到大量的有机试剂，且所得到的鼠李糖脂粗品纯度极低；柱层析法过程中需要用到氯仿、甲醇等存在安全隐患的强毒性化学试剂；膜分离过程中，较高粘度的发酵液会对膜造成损害，极大程度降低膜的使用寿命，且总体回收率低。鼠李糖脂下游分离纯化的复杂程度及其高成本极大地限制了鼠李糖脂的大规模生产应用，目前关于鼠李糖脂的分离多处于实验室阶段，很少形成工业化的规模。
技术实现思路
为解决现有技术的缺点和不足之处，本专利技术的目的在于提供一种分离纯化生物表面活性剂鼠李糖脂的方法。本专利技术对现有的鼠李糖脂分离纯化方法进行改进，优化提取工艺，从而提高了鼠李糖脂的纯化浓度。本专利技术目的通过以下技术方案实现：一种分离纯化生物表面活性剂鼠李糖脂的方法，包括以下步骤：(1)将鼠李糖脂发酵液过滤，收集滤液，离心，取上清液；(2)用酸调节步骤(1)上清液的pH，使鼠李糖脂析出，静置，离心，收集沉淀；(3)用碳酸氢钠溶液重悬步骤(2)的沉淀，自然沉降，收集上清液；(4)用酸调节步骤(3)上清液的pH，使鼠李糖脂析出，静置，离心，收集沉淀；(5)将步骤(4)的沉淀加入有机溶剂中进行萃取，收集有机相，将有机相与磷酸盐缓冲溶液混匀，静置分层，使有机相中的鼠李糖脂反萃取到水相中，下层水相即为纯化后的鼠李糖脂溶液。优选地，步骤(1)所述鼠李糖脂发酵液由鼠李糖脂生产菌，利用玉米油为碳源发酵得到的含鼠李糖脂的发酵液，按质量分数计，发酵培养基为：碳源玉米油4～8％，氮源硝酸钠0.4～0.8％、磷酸二氢钠0.2～0.4％、磷酸氢二钾0.3～0.6％、无水氯化钙0.001～0.004％、硫酸亚铁0.002～0.004％，硫酸镁0.02～0.04％，余量为水，pH7～7.2。优选地，步骤(1)所述过滤指用纱布过滤除去发酵液中大颗粒物质。优选地，步骤(1)所述离心指收集到的鼠李糖脂发酵液在8000～10000rpm下离心10～15min。离心的目的在于除菌。优选地，步骤(2)和(4)所述酸均为磷酸、盐酸和硫酸中的至少一种，所述酸以溶液的形式加入，酸溶液的浓度为4～6mol/L，将上清液的pH调至2～3。步骤(2)和(4)所述静置均可在4℃环境中静置8～12h。优选地，步骤(2)和(4)所述离心均指在4000～10000rpm下离心8～10min。优选地，步骤(3)所述碳酸氢钠溶液的浓度为0.05～0.1mol/L，溶剂为水。优选地，步骤(3)所述碳酸氢钠溶液与步骤(2)沉淀的质量比为10：1～20：1。优选地，步骤(3)所述重悬、自然沉降和收集上清液的操作重复1～3次，重复1次的操作即是将所得的上清液用碳酸氢钠溶液重悬，自然沉降后收集上清液。步骤(3)的目的在于洗涤纯化鼠李糖脂。优选地，步骤(5)所述有机溶剂为氯仿和乙酸乙酯中的至少一种。优选地，步骤(5)所述有机溶剂与步骤(4)沉淀的质量比为10：1～20：1。优选地，步骤(5)所述有机溶剂萃取1～5次。优选地，步骤(5)所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7～8；磷酸盐缓冲溶液的体积为有机相体积的1～3倍。所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1～0.2mol/L。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果：(1)本专利技术在现有的方法上进行改进，利用缓冲溶液将有机溶剂中的鼠李糖脂反萃取到水相中，该方法最终得到澄清透明的鼠李糖脂水溶液，可以根据需要进行稀释或浓缩。(2)本专利技术使用相对较少的有机溶剂即可实现鼠李糖脂分离纯化，使用的有机溶剂乙酸乙酯毒性低，且可循环利用，使用的设备简单易得。(3)本专利技术从发酵液中分离纯化得到鼠李糖脂，也可以对鼠李糖脂粗品进行进一步纯化，根据本专利技术所述方法得到的鼠李糖脂比化学表面活性剂十二烷基硫酸钠具有更好的表面性质和起泡性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑菌效果显著优于壳聚糖。附图说明图1为本专利技术所分离纯化得到的鼠李糖脂外观图。图2为本专利技术所分离纯化得到的鼠李糖脂的临界胶束浓度图。图3为本专利技术所分离纯化得到的鼠李糖脂和SDS、吐温80、CTAC对三种疏水化合物乳化指数图。图4为本专利技术所分离纯化得到的鼠李糖脂和SDS的起泡性图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。本专利技术实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本专利技术实施例和对比例所用的鼠李糖脂发酵液由鼠李糖脂生产菌，利用玉米油为碳源发酵得到的含鼠李糖脂的发酵液，按质量分数计，发酵培养基为：碳源玉米油6％，氮源硝酸钠0.68％、磷酸二氢钠0.32％、磷酸氢二钾0.48％、无水氯化钙0.002％、硫酸亚铁0.0024％，硫酸镁0.04％，余量为水，pH7。对比例1(1)将420mL鼠李糖脂发酵液纱布过滤后均匀的分装于4个离心杯中，高速离心机8000rpm离心10min，收集上清液。(2)将步骤(1)中收集的上清液倒入量筒中，准确量体积测得剩余体积为410mL，用6mol/L的盐酸将除菌发酵上清液的pH调为2，将调完pH的上清液置于4℃的冰箱中静置12h，鼠李糖脂沉淀析出。(3)将步骤(2)中的产生沉淀的发酵液用高速离心机在8000rpm的条件下离心10min，富集沉淀。(4)将(3)中的沉淀用20mL浓度为0.05mol/L的碳酸氢钠水溶液重悬洗涤，自然沉降，收集上清液，重复重悬-自然沉降-收集上清液的操作3次。(5)将(4)中的上清液用6mol/L的盐本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离纯化生物表面活性剂鼠李糖脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将鼠李糖脂发酵液过滤，收集滤液，离心，取上清液；/n(2)用酸调节步骤(1)上清液的pH，使鼠李糖脂析出，静置，离心，收集沉淀；/n(3)用碳酸氢钠溶液重悬步骤(2)的沉淀，自然沉降，收集上清液；/n(4)用酸调节步骤(3)上清液的pH，使鼠李糖脂析出，静置，离心，收集沉淀；/n(5)将步骤(4)的沉淀加入有机溶剂中进行萃取，收集有机相，将有机相与磷酸盐缓冲溶液混匀，静置分层，使有机相中的鼠李糖脂反萃取到水相中，下层水相即为纯化后的鼠李糖脂溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离纯化生物表面活性剂鼠李糖脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将鼠李糖脂发酵液过滤，收集滤液，离心，取上清液；
(2)用酸调节步骤(1)上清液的pH，使鼠李糖脂析出，静置，离心，收集沉淀；
(3)用碳酸氢钠溶液重悬步骤(2)的沉淀，自然沉降，收集上清液；
(4)用酸调节步骤(3)上清液的pH，使鼠李糖脂析出，静置，离心，收集沉淀；
(5)将步骤(4)的沉淀加入有机溶剂中进行萃取，收集有机相，将有机相与磷酸盐缓冲溶液混匀，静置分层，使有机相中的鼠李糖脂反萃取到水相中，下层水相即为纯化后的鼠李糖脂溶液。


2.根据权利要求1所述一种分离纯化生物表面活性剂鼠李糖脂的方法，其特征在于，步骤(5)所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7～8；磷酸盐缓冲溶液的体积为有机相体积的1～3倍；所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1～0.2mol/L。


3.根据权利要求1所述一种分离纯化生物表面活性剂鼠李糖脂的方法，其特征在于，步骤(3)所述碳酸氢钠溶液的浓度为0.05～0.1mol/L，溶剂为水。


4.根据权利要求1所述一种分离纯化生物表面活性剂鼠李糖脂的方法，其特征在于，步骤(3)所述碳酸氢钠溶液与步骤(2)沉淀的质量比为10：1～20：1。


5.根据权利要求1所述一种分离纯化生物表...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗志刚，杨欢，齐亮，
申请(专利权)人：华南理工大学，广州现代产业技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44