一种具有乙醇脱氢酶激活功效的中药材的高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种具有乙醇脱氢酶激活功效的中药材的高通量筛选方法，首先将待筛选的若干种中药材分别粉碎，再分别用有机溶剂提取，离心过滤，得若干上清液作为待测样本溶液；再在微孔板中加入反应体系；将空白对照样品和待测样品与反应底物混合，摇匀后立即开始测定各样品在340nm处的吸光值；利用酶标仪自带软件记录吸光度值并绘制出空白对应样品及待测样品吸光度值变化曲线；得出样品曲线净面积Net AUC值；本发明专利技术方法一次可筛选多种中药材，快速、准确率高，操作方便。

【技术实现步骤摘要】
一种具有乙醇脱氢酶激活功效的中药材的高通量筛选方法
本专利技术属于中药领域，具体涉及一种具有乙醇脱氢酶激活功效的中药材的高通量筛选方法。
技术介绍
中国是一个具有深厚酒文化底蕴的国家，但过量饮酒给人类健康和社会治安造成危害的报道已屡见不鲜。传统中药用于解酒有悠久的历史。目前，我国常用中药材达几百种，如何从常用中药材中寻找具有一定解酒功效的中药，并将其开发成具有解酒功效，安全方便的药物或保健品，使醉酒者服用后可快速起效，已成为相关行业开发解酒产品的主要途径。酒精代谢重要步骤是乙醇在乙醇脱氢酶作用下代谢成乙醛、乙醛在乙醛脱氢酶作用下进一步代谢成为乙酸和水。目前尚未有乙醇脱氢酶活性测定的高通量方法，乙醇脱氢酶活性测定目前常规的筛选方法一次只能筛选一种中药，耗时长，试剂用量大，不能满足企业产品开发的需求。常规方法均采用终点法(测定反应某一时间点的结果作为最终评估结果)进行测定，同时大量测样较为困难且耗时，反应过程不明朗，且反应终点的选取对测定结果影响较大。本研究所在中国专利技术专利CN103983598A中提出了一种具有解酒功效的中药材及活性因子的高通量筛选方法，主要通过建立筛选反应体系，检测药材对乙醛脱氢酶激活能力；开发完成了乙醛脱氢酶激活剂模型的建立，提高了乙醇代谢的后端速度，若能在乙醇代谢的全程提高各代谢酶的活性，能更快的代谢酒精，降低酒精对人体的损伤。高通量分析模型是基于乙醇或乙醇次级代谢产物乙醛在脱氢酶和NAD+作用下，氧化成乙酸，同时NAD+还原成NADH，而NADH在340nm处有特征吸收这一机理建立起来的，通过比较340nm下生成物吸光度的大小及变化，可以得到加入物质对乙醇酶的激活作用。该高通量分析模型不但反应条件可控，稳定，而且效率高，可以在短时间内完成上百种药材的筛选。利用酶标仪采用曲线面积法建立相应的体外高通量筛选模型对乙醇脱氢酶激活剂进行筛选，可同时间快速大规模测样，并客观且准确地反映样品对乙醇脱氢酶的激活能力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提出一种具有乙醇脱氢酶激活功效的中药材的高通量筛选方法，提高具有乙醇脱氢酶激活功效的中药材筛选效率。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种具有乙醇脱氢酶激活功效的中药材的高通量筛选方法，包括以下步骤：待测样本溶液制备：将待筛选的活性因子或中药材分别粉碎，用不同种类及浓度的有机溶剂进行提取，固液分离，得若干上清液作为待测样本溶液。反应底物配制：在反应器皿中加入缓冲溶液、乙醇脱氢酶以及乙醇，制成反应底物；活性筛选：取检测样本溶液稀释后加入反应底物，之后加入NAD+溶液，震荡后使用酶标仪记录其吸光度并绘制曲线，将样品吸光度曲线与空白吸光度曲线进行对照，计算激活效果。优选的是，所述待测样本溶液制备步骤中，药材粉碎粒度为20-100目。优选的是，所述待测样本溶液制备步骤中，使用的有机溶剂为30％～90％乙醇、甲醇和丙酮中的一种。优选的是，所述待测样本溶液制备步骤中，使用离心分离的方法进行固液分离。优选的是，所述反应底物的组分为：50mmol/L、pH7.8-8.8的焦磷酸钠缓冲液20-100μL,,0.1-5U/ml乙醇脱氢酶6-30μL,10％-50％乙醇6-30μL。优选的是，所述活性筛选步骤中，NAD+溶液的浓度为0.625-20mmol/L，体积为6-30μL。优选的是，所述活性筛选步骤中，使用酶标仪对生成物吸光度进行测定时，测定波长为340nm。优选的是，所述活性筛选步骤中，用空白吸光度曲线下面积(AUC空白)减去样品作用曲线下的积分面积(AUC样品)，得出曲线下净面积(NetAUC)，曲线下净面积(NetAUC)与空白曲线下面积的比值即为激活率，计算公式为：激活率％＝(AUC空白-AUC样品)/AUC空白×100。优选的是，当激活率为正数时证明该样品中具有激活乙醇脱氢酶的能力；反之，激活率为负数时，说明该样品具备抑制乙醇脱氢酶的能力。本专利技术产生的有益效果是：利用高通量方法对具有乙醇脱氢酶激活/抑制作用的中药材或活性因子进行筛选，根据需要选择不同规格的微孔板，一次最多可筛选上百种或几百种中药材或活性因子，耗时短，精确率高，试剂用量少；选用的反应体系简单，操作方便；根据辅酶I变化吸收值来筛选乙醇脱氢酶活性，为大规模筛选乙醇脱氢酶激活/抑制剂提供模型。本专利技术的高通量分析模型可全程监控NADH生成量，使反应过程表现为吸光度数值变化，全面且直观掌控酶反应变化过程。实现反应全程数字化，可视化，实现反应过程可控且高效。具体实施方式实施例1将待筛选的95种中药材(见表1)分别粉碎过100目药典筛后，分别用70％乙醇提取60分钟，离心分离(6000rpm,15min)，得各药材的上清液；此上清液即为待测样本溶液。表1在微孔板中的每个微孔中加入下述反应体系：在微孔板中的每个微孔中加入下述反应体系：50mmol/L焦磷酸钠缓冲溶液(pH值为8.8)100μL，2.0U/mL乙醇脱氢酶30μL，20％乙醇溶液30μL，再在上述其中一个微孔中加入50mmol/L焦磷酸钠缓冲溶液(pH值为8.8)30μL作为空白对照，其他孔加入样品溶液30μL；然后每个孔迅速加入2.0mmol/LNAD+溶液30μL。振荡5秒立即开始全板扫描监测各样品在340nm处的吸光值变化；利用酶标仪自带软件记录吸光度值并绘制出空白对应样品及待测样品吸光度值变化曲线；将所得到的待测样品曲线的积分面积(AUC样品)减去空白对应样品的曲线积分面积(AUC空白)，得出样品曲线净面积NetAUC值，此值即为激活率，激活率公式如下：激活率％＝(AUC空白-AUC样品)/AUC空白×100激活率为正数时证明该样品中所加入的中药材或活性因子具有激活乙醇脱氢酶的能力；反之，激活率为负数时，说明该样品中所加入的中药材或活性因子具有抑制乙醇脱氢酶的能力。本实施例中，百合的激活率为30％，为正数，具有乙醇脱氢酶激活作用，激活率为正数的还有葛根、阿胶、黄芪、郁金，知母等，其他药材激活率为负数，不具有乙醇脱氢酶激活作用。将所筛选出的活性最高的百合提取液进行小鼠醉酒实验显示，给予百合提取液的实验组小鼠醉酒率明显降低，说明用本专利技术方法筛选的中药材确实具有一定的解酒的功效，也说明本专利技术方法用于也可作为具有解酒功效中药材的筛选，是切实可行的。实施例2将待筛选的5种活性因子(葛根素、L-半胱氨酸、琥珀酸、桑叶提取物、枸杞子提取物)，分别用70％乙醇溶解，离心分离(7500rpm,10min)后，得上清液；此上清液即为待测样本溶液；在微孔板中的每个微孔中加入下述反应体系：在微孔板中的每个微孔中加入下述反应体系：50mmol/L焦磷酸钠缓冲溶液(pH值为8.8)100μL，2.0U/mL乙醇脱氢酶30μL，20％乙醇溶液30μL，再在上述其中一个微孔中加入50mmol/L焦磷本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有乙醇脱氢酶激活功效的中药材的高通量筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：/n待测样本溶液制备：将待筛选的中药材分别粉碎，用不同种类及浓度的有机溶剂进行提取，固液分离，取若干上清液作为待测样本溶液。待筛选的活性因子用不同种类及浓度溶剂溶解,取若干上清液作为待测样本溶液。/n反应底物配制：在微孔板中加入缓冲溶液、乙醇脱氢酶以及乙醇，制成反应底物；/n活性筛选：取检测样本溶液稀释后加入反应底物，之后加入NAD+溶液，震荡后使用酶标仪记录其吸光度并绘制曲线，将样品吸光度曲线与空白吸光度曲线进行对照，计算激活效果。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有乙醇脱氢酶激活功效的中药材的高通量筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
待测样本溶液制备：将待筛选的中药材分别粉碎，用不同种类及浓度的有机溶剂进行提取，固液分离，取若干上清液作为待测样本溶液。待筛选的活性因子用不同种类及浓度溶剂溶解,取若干上清液作为待测样本溶液。
反应底物配制：在微孔板中加入缓冲溶液、乙醇脱氢酶以及乙醇，制成反应底物；
活性筛选：取检测样本溶液稀释后加入反应底物，之后加入NAD+溶液，震荡后使用酶标仪记录其吸光度并绘制曲线，将样品吸光度曲线与空白吸光度曲线进行对照，计算激活效果。


2.根据权利要求1所述一种具有乙醇脱氢酶激活功效的中药材的高通量筛选方法，其特征在于：所述待测样本溶液制备步骤中，药材粉碎粒度为20-100目。


3.根据权利要求2所述一种具有乙醇脱氢酶激活功效的中药材的高通量筛选方法，其特征在于：所述待测样本溶液制备步骤中，使用的有机溶剂为30％～90％乙醇、甲醇和丙酮中的一种。


4.根据权利要求1所述一种具有乙醇脱氢酶激活功效的中药材的高通量筛选方法，其特征在于：所述待测样本溶液制备步骤中，使用离心分离的方法进行固液分离。


5.根据权利要求1所述一种具有乙醇脱氢酶激活功效的中药材的高通量筛选方法，其特征在于：在微孔板中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖富丽，杨跃军，徐剑，陈志超，陈琪瑶，崔灵敏，康丹丹，周俊强，
申请(专利权)人：劲牌有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42