一种水稻镉耐受蛋白OsCSD2的OsmiR398b干涉片段及应用制造技术

本发明专利技术专利属于水稻品种基因工程领域，具体一种水稻镉耐受蛋白OsCSD

【技术实现步骤摘要】
一种水稻镉耐受蛋白OsCSD2的OsmiR398b干涉片段及应用
本专利技术专利属于水稻品种基因工程领域，具体一种水稻镉耐受蛋白OsCSD2的OsmiR398b干涉片段及应用，通过干扰OsmiR398b基因可用于提高植物对重金属镉的抗性，降低镉污染对水稻的不良影响。
技术介绍
稻田镉污染问题日益严峻，已经成为农作物质量安全的严重隐患。水稻是中国最重要的粮食作物，能够富集和积累较多的镉，镉在水稻中的积累会造成营养缺乏、叶绿素合成抑制、光合作用降低、氧化应激等毒害反应。更为严重的是，镉通过食物链在人体中，会引起人体多种疾病发生，包括痛痛病、肾功能紊乱、心脑血管疾病，甚至癌症，镉积累也对整个粮食产业、加工出口均造成了重大打击。目前，培育低Cd水稻，保障粮食生产安全是我们迫切需要解决的问题之一。随着稻田镉污染问题的日益严峻，关于水稻耐镉性能也不断在研究中，例如公开号为CN105755022A、公开日20160713的中国专利技术专利申请专利公开的一种水稻耐镉基因OsGSTU5及其编码蛋白，基因OsGSTU5编码表达蛋白质谷胱甘S-转移酶（glutathione-S-transferase,GSTs），催化谷胱甘肽（glutathione,GSH）与镉螯合，促进镉的代谢隔离，从而提高植物耐镉能力。其通过构建OsGSTU5基因的水稻过表达株系，提高水稻植株对镉胁迫的耐受能力。通过水稻耐镉基因OsGSTU5的生理特性及调控机制研究，为镉胁迫下植物的生理功能及调控机理研究提供了基因资源和理论依据，同时为GSTs蛋白超级家族的功能研究提供基因资源。又如公开号为CN111041035A、公开日20200421的中国专利技术专利申请专利研究的水稻转录因子OsNAC3在提高植物耐镉能力中的应用，将所述的OsNAC3基因的超表达载体转入宿主，能够提高宿主植物的耐镉性，因此，OsNAC3基因在增加植物耐镉能力方面具有良好应用前景。研究还显示，镉在植物体内的过多积累，会诱导产生活性氧（ROS，如过氧化氢、超氧阴离子、氧自由基等），ROS能被抗氧化物和抗氧化物酶有效清除，这些抗氧化物和抗氧化物酶能够缓解水稻镉的毒害，其对水稻镉的吸收和积累没有一致结果。超氧化物歧化酶（SOD）是清除植物体内多余的ROS的一种重要酶，是保障植物氧化还原平衡的关键酶，能够保障镉胁迫条件下的水稻生长安全。因此，提高SOD酶活性，不但能够增加植物对外界镉污染生态环境的抗逆性，也能够通过改善膳食（高SOD大米）增加人体抵抗机能。研究表明，CSD2基因表达是产生SOD酶及活性的关键，CSD2基因敲除显著降低水稻SOD酶活性，严重抑制水稻生长，CSD2基因表达量增加能够增加SOD酶含量及清除活性氧的能力。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供miR398b前体序列片段的核苷酸序列，如SEQIDNO：1所示。CSD2基因的转录和翻译受非编码RNAs（miRNA）负调控，miR398b是一种非编码RNA分子，长度约为20-22个核苷酸，能通过序列特异性方式切割CSD2基因的转录或通过翻译抑制其表达。通过干扰miR398b基因表达将上调CSD2基因以及蛋白表达量，增加水稻对镉抗逆性。本专利技术首次公布了miR398b在镉积累以及水稻抗镉过程中起到了至关重要的作用，能够显著缓解水稻镉的毒害，降低镉的积累，减少水稻镉毒害风险的途径和方法。本专利技术的第二目的是提供一种OsmiR398b干涉片段，其负链具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，5’-AGAGTCCCGGCAGGGGCGACCTGAGAACACACGAAAGACCAGACCGCCTCATACCGTGTGTTCCCAGCTCGCCCCTGTAGGAACTCC-3’。正链具有SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，5’-GGAGTTCCTACAGGGGCGAGCTGGGAACACACGGTGATGAGGCGGTCTGGTCTTTCGTGTGTTCTCAGGTCGCCCCTGCCGGGACTCT-3’。利用此RNA干涉片段能够显著的降低水稻中的重金属镉的积累量。本专利技术的第三个目的是提供一种miR398b干涉片段的表达载体，该表达载体克隆有上述针对水稻金属耐受蛋白基因OsCSD2的OsmiR398b干涉片段。本专利技术的第四目的是提供OsmiR398b干涉片段的应用，用于增加植物对金属的抗性。进一步说，是增加植物对镉金属的抗性。尤其是，增加水稻对镉金属的抗性，同时也降低水稻镉的积累量。通常认为，水稻耐镉性能的提升，是因为诱导了水稻体内相关的抗性蛋白（例如谷胱甘肽、螯合肽、金属硫蛋白）的过量表达，能够将镉螯合在液泡等非代谢区域，减少可食用部分的毒害症状，但是水稻本身体内的镉积累量并不会减少，反而会被认为是生长良好的水稻被误食。而在本申请敲除OsmiR398b基因的水稻中意外发现，水稻镉的积累量降低了。本专利技术的第五目的是一种提升水稻耐镉性的方法，降低水稻OsmiR398b的表达量。本专利技术通过CRISPR-Cas9技术基因敲除OsmiR398b基因，显著增加了OsCSD2基因在水稻中的表达量，提高了水稻SOD酶活性，增加水稻对镉的抗性，同时也降低水稻镉的积累量。目前虽然有研究表明OsmiR398b及其靶基因参与了水稻Cd和铜胁迫响应，但是还未有OsmiR398b调控镉抗性和积累量的报道。本专利技术公布了非编码RNAs的OsmiR398b的基因新功能及应用方法，为水稻及其他作物品种基因育种提供新的方法和途径。附图说明附图1为CRISPR-Cas9骨架载体的T-DNA区结构图；附图2为水稻遗传转化过程图；附图3为OsmiR398b敲除植株目的片段PCR鉴定图；附图4为CdCl2处理对野生型（WT）和转基因水稻生长变化的影响。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术为达成预定专利技术目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对本专利技术进行进一步地详细说明。下述实施方式中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1：miR398b干涉片段的表达载体的构建：（1）获取OsmiR398b基因序列及靶位点利用miRBase数据库，筛选OsmiR398b序列和前体序列，并对OsmiR398b的基因组序列进行确认，在OsmiR398b转录之前，其前体序列的正链和负链上分别设计Cas9识别靶标记位点。前体序列为：5’-GGAGTTCCTACAGGGGCGAGCTGGGAACACACGGTGATGAGGCGGTCTGGTCTTTCGTGTGTTCTCAGGTCGCCCCTGCCGGGACTCT-3’。（2）引物设计并获得向导RNA（sgRNA）片段在上、下游引物的5’端分别加上tgca和aaac作为酶切接口，添加cagt作为保护位点，GGTCTCA作为酶切识别位点。OsmiR398b的Prime本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻镉耐受蛋白OsCSD

【技术特征摘要】
1.一种水稻镉耐受蛋白OsCSD2的miR398b的前体序列，其特征在于，其核苷酸序列，如SEQIDNO：1所示。


2.一种OsmiR398b干涉片段，其特征在于，其负链具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，正链具有SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。


3.一种miR398b干涉片段的表达载体，其特征在于，该表达载体克隆有如权利要求2所述的OsmiR398b干涉片段。


4.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨永杰，熊杰，高彩霞，唐伟，
申请(专利权)人：中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33