一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种假地豆植物中碳糖基转移酶

【技术实现步骤摘要】
一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因及在制备牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷上的应用。
技术介绍
药用植物假地豆Desmodiumheterocarpon(L.)DC.为豆科(Leguminosae)山蚂蝗属(Desmodium)，在国内外均有分布，我国主要分布于云南和广东等地区。假地豆全草入药，具有止痛、清热、利尿、消炎、平肝、解毒、活血、止咳平喘的功效。据《中华本草》记载假地豆对治疗流行性乙型脑炎、肝炎、腮腺炎效果显著。假地豆中主要含有黄酮苷、生物碱、萜类等药用成分，具有较高的药用价值和饲用价值。相关文献报道，夏佛塔苷和异夏佛塔苷是广泛存在于粮食作物和中草药等高等植物中的具有生物活性的天然产物。它们的生物合成可能与植物防御有关。它们对哺乳动物具有多种生物活性，包括抗呼吸道病毒、抗糖尿病、抗高血压、保肝、抗炎和抗氧化活性，这预示着它们作为药物或膳食补充剂的潜在应用。目前，针对氧糖基转移酶(OGTs)的研究较为广泛，但对碳糖基转移酶(CGTs)的关注较少。近些年来，黄酮碳苷以其显著的药理活性和不易水解的稳定结构吸引了科研人员对CGTs的广泛关注。目前研究发现CGT基因主要有水稻、玉米、小麦、芒果、葛根、三花龙胆、金橘、蜜柑、石斛、山葵、光果甘草、芦荟、黄芩和金莲花等14中单子叶和双子叶植物中。植物中的大部分CGT能够一步催化2-羟基黄烷酮发生碳糖基化生成相应黄酮的6位和8位单碳糖苷，如牡荆素、异牡荆素、葛根素、红草苷和异红草苷等。目前只有黄芩中SbCGTb能二步发生糖基化反应生成双碳糖苷夏佛塔苷和异夏佛塔苷。有关药用植物假地豆中黄酮碳苷的生物合成途径中关键酶CGTs的研究还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因，可作为牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷的生物合成调控基因以及应用于制备牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术第一方面提供一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因，该假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，序列全长1422bp。本专利技术第二方面提供上述假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因的编码蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，编码了473个氨基酸残基。本专利技术第三方面提供含有上述假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因中目的基因的重组质粒。进一步，优选的是，将假地豆碳糖基转移酶DhCGT2基因与pET28a载体同源重组，获得pET28a-DhCGT2重组质粒。具体地，与载体pET28a进行同源重组时，DhCGT2基因则需要使用用带同源壁的引物进行扩增及回收，带同源壁的引物如下：5'F：cagcaaatgggtcgcggatcccgatgaagaaagcagcacggc；(SEQIDNO.3)3'R：tggtggtgctcgagtgcggcccgcaattacgaggatacttgattcattatataatcaatg。(SEQIDNO.4)本专利技术第四方面提供一种转基因工程菌，含有上述重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的上述的碳糖基转移酶DhCGT2基因。进一步，优选的是，所述转基因工程菌为大肠杆菌BL21DE3。本专利技术第四方面提供所述的假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因在制备夏佛塔苷和异夏佛塔苷中的应用。进一步，优选的是，以二羟基柚皮素(2-Hydroxynaringgenin)作为底物，以UDP-葡萄糖和UDP-阿拉伯糖作为糖供体，在由所述的碳糖基转移酶DhCGT2基因编码得到的碳糖基转移酶DhCGT2的催化下能催化生成黄酮碳苷化合物。第一步碳糖基化反应在二羟基柚皮素的C-6位或C-8上连接上葡萄糖生成牡荆素或者异牡荆素，第二步糖基化反应以生成牡荆素、或异牡荆素作为底物在C-6位或C-8接上阿拉伯糖从而生成夏佛塔苷或异夏佛塔苷。本专利技术通过重组质粒，在体外表达后获得目标蛋白，经进一步对底物二羟基柚皮素进行催化，第一步糖基化反应生成牡荆素或异牡荆素，第二步糖基化反应以第一步反应生成的产物作为底物进一步糖基化反应生成夏佛塔苷或异夏佛塔苷。本专利技术所述的碳糖基转移酶DhCGT2基因，是从假地豆植物根中提取，通过转录组测序及生物信息学技术分析，经大量试验后筛选后得以鉴定出来；采用RNA试剂盒提取假地豆根RNA，并反转成cDNA后进行PCR扩增获得。所述的碳糖基转移酶DhCGT2基因的扩增引物如下所示：5'F：atgaagaaagcagcacggc；(SEQIDNO.5)3'R：ttacgaggatacttgattcattatataatcaatg。(SEQIDNO.6)从假地豆中分离并鉴定的碳糖基转移酶DhCGT2，同时也可作生产夏佛塔苷和异夏佛塔苷的重要候选基因，异夏佛塔苷也是寄生植物独脚金种子萌发的抑制剂。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：本专利技术提供假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因，可作为夏佛塔苷和异夏佛塔苷的生物合成调控基因以及应用于制备夏佛塔苷和异夏佛塔苷。利用体外生物异源表达生成夏佛塔苷和异夏佛塔苷，解决了依靠野生药用植物资源提取牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷的短板，本专利技术通过通过异源表达的方法通过微生物生物合成牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷，在保护野生药用植物资源的同时，促进了以牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷药物的发展，为牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷在植物化感方面的推广应用提供了基础。附图说明图1为牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷推导的合成路径示意图；图2为推测CGT催化反应生成夏佛塔苷和异夏佛塔苷合成关键示意图；图3为重组表达质粒pET28a-DhCGT2的构建示意图(用于表达碳糖基转移酶DhCGT2基因)；图4为DhCGT2重组后的电泳检测；M：NormalRunTMprestained250bp-I/IIDNAladderDNAMarker(250bp-I/II的核酸Marker)；1：重组目的基因；图5为DhCGT2的SDS-PAGE蛋白电泳检测图；其中，M：蛋白质分子质量标准；1为DhCGT2未不经过镍柱纯化的目的蛋白电泳检测；2为经过镍柱纯化的后的DhCGT2蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳检测；箭头为纯化目标蛋白；图6为HPLC检测碳糖基转移酶DhCGT2酶活反应产物检测结果；Ⅰ表示4个化合物混合标准品液相分类图；Ⅱ表示酶反应空白对照试验液相检测图；Ⅲ为DhCGT2以二羟基柚皮素为底物和以UDP-glucose为糖供提的酶反应生成黄酮单糖牡荆素和异牡荆素的液相检测图；Ⅳ为DhCGT1以二羟基柚皮素和以UDP-glucose和UDP-arab本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种假地豆植物中碳糖基转移酶

【技术特征摘要】
1.一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因，其特征在于，假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述的假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因的编码蛋白，其特征在于，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.含有权利要求1所述的假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因中目的基因的重组质粒。


4.根据权利要求3所述的含有假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因中目的基因的重组质粒，其特征在于，将假地豆碳糖基转移酶DhCGT2基因与pET28a载体同源重组，获得pET28a-DhCGT2重组质粒。


5.一种转基因工程菌，含有权利要求1所述的重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的权利要求1所述的碳糖基转移酶DhCGT2基...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝冰，袁慧娟，张广辉，杨生超，刘祥宇，谢家伟，陈小巧，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53