黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用制造技术

本发明专利技术公开一种黄酮醇3‑O‑半乳糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用。该基因从杨梅果实中分离获得，所述基因为MrUGT78D2，其核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。本发明专利技术首次克隆并验证了杨梅黄酮醇3‑O‑半乳糖苷合成相关的MrUGT78D2基因的功能，通过构建重组质粒，实现MrUGT78D2基因在大肠杆菌中的重组表达，提供转基因工程菌和纯化的重组蛋白。在体外，重组蛋白可以高效地将槲皮素转化成槲皮素3‑O‑半乳糖苷。本发明专利技术可用于生物合成大量植物黄酮醇糖苷，应用于提高植物黄酮醇含量和组分改良的基因工程中，并为实现黄酮醇糖苷类物质商品化生产提供代谢工程基础。

【技术实现步骤摘要】
黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用
本专利技术属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用，是一种参与杨梅黄酮醇3-O-半乳糖苷生物合成的转移酶MrUGT78D2基因及其编码蛋白和应用。
技术介绍
黄酮醇是类黄酮化合物的一类，通常以糖苷衍生物形式存在于植物液泡中。黄酮醇广泛存在于植物根、茎、叶、花、果实和种子中，对植物生长发育和抵抗逆境等发挥着重要作用，包括调控生长素转运、促进侧根形成、影响花粉发育、抗紫外线等。近些年，植物黄酮醇抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病、消炎等医药学活性被大量报道，黄酮醇生物合成与代谢调控研究引发大量关注。杨梅(Morellarubra)属于我国特色水果，富含黄酮醇化合物，具有良好的医药学活性。杨梅中的黄酮醇主要有杨梅素、槲皮素及其糖苷化合物，包括杨梅素3-O-鼠李糖苷、槲皮素3-O-半乳糖苷、槲皮素3-O-葡萄糖苷、槲皮素3-O-鼠李糖苷等。其中槲皮素3-O-半乳糖苷具有抗炎、降压、降糖以及对心、脑血管的保护作用等多种生理活性。黄酮醇糖基化主要发生在细胞质中，在糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,EC2.4.x.y)的催化下，将活化的糖供体分子转移到受体分子上。糖基化可以改变黄酮醇化合物的亲水性，增加其溶解度和化学稳定性，影响其生物活性，有助于其在细胞内和生物体内的储存和转运等。杨梅果实中含有大量黄酮醇糖苷，是决定杨梅生物学活性的重要组成成分，因此鉴别出杨梅黄酮醇糖苷生物合成相关的糖基转移酶，阐明杨梅黄酮醇糖苷生物合成途径具有重要意义。此外，也可用于其他植物基于分子育种、基因工程技术的品种改良工作，应用于代谢工程工业化生产黄酮醇糖苷，对提高食物中的黄酮醇含量，增加食物的保健功能，提高药品产量，具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶基因及其编码蛋白，所述基因为MrUGT78D2，所述MrUGT78D2基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，编码序列全长为1410个核苷酸，其氨基酸序列如SEQ:NO.2所示，可编码一个含469个氨基酸的蛋白。本专利技术提供的一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MrUGT78D2基因，是从杨梅果实中分离获得，为一种尿苷二磷酸半乳糖依赖的黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶。本专利技术的另一个目的是提供所述黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MrUGT78D2基因及其编码蛋白在合成黄酮醇3-O-半乳糖苷中的应用。将上述黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MrUGT78D2基因连接到pET-32a(+)载体的多克隆位点中构建获得重组质粒，命名为pET-32a(+)-MrUGT78D2。在大肠杆菌中表达pET-32a(+)-MrUGT78D2，得到MrUGT78D2重组蛋白，可利用UDP-半乳糖苷作为糖供体将黄酮醇转化成黄酮醇3-O-半乳糖苷。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术提供了一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MrUGT78D2基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了杨梅黄酮醇3-O-半乳糖苷生物合成相关糖基转移酶MrUGT78D2基因的功能，在体外，MrUGT78D2重组蛋白可以高效地将槲皮素转化成槲皮素3-O-半乳糖苷。本专利技术还提供了含有MrUGT78D2基因的重组质粒和转基因工程菌，为通过代谢工程方法大量合成黄酮醇3-O-半乳糖苷提供靶基因。本专利技术提供了一种能大量合成黄酮醇3-O-半乳糖苷的途径，进一步开展黄酮醇糖苷生物合成调控研究奠定基础。附图说明图1：杨梅果实发育阶段过程中槲皮素3-O-半乳糖苷含量变化。图2：杨梅MrUGT78D2蛋白与其他植物UGT系统发育树分析。AtUGT78D1(AAF19756),AtUGT78D2(CAC01718),VvGT1(AAB81683),VvGT5(AB499074),VvGT6(AB499075),FaGT1(AAU09442),Ph3GT(BAA89008),Perilla3GT(BAA19659),PhF3GalT(AAD55985),CsUGT78A14(ALO19888),CsUGT78A15(KP682361),PpUGT78B(ONI25885),Iris5GT(BAD06874),Gt5GT7(BAG32255),Perilla5GT(AB013596),Verbena5GT(AB013598),Ph5GT(AB027455),Torenia5GT(AB076698),AtUGT89C1(AAM13132),AtUGT73B1(AEE86330),AtUGT73C6(AEC09298),SbUBGT(BAA83484),LeABRT2(LC131336),LeABRT4(LC131337),Petunia3RT(CAA50376),Cs16RhaT(ABA18631),GmF3G6Rt(BAN91401),Ip3GGT(BAD95881),AtUGT79B1(AED96443),AtUGT79B6(AED96438).图3：MrUGT78D2氨基酸序列SEQ:NO.2比对结果；VvGT6(AB499075)，PhF3GalT(AAD55985)，CsUGT78A15(KP682361)。图4：杨梅MrUGT78D2重组蛋白SEQ:NO.2的SDS-PAGE凝胶电泳分析图。图5：重组蛋白MrUGT78D2对槲皮素体外酶活性分析HPLC图谱。图6：黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MrUGT78D2催化模式图；以UDP-半乳糖为糖供体，槲皮素为糖受体，经MrUGT78D2催化生成槲皮素3-O-半乳糖苷。具体实施方式下面对本专利技术的实施例和附图作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：一、材料1、杨梅品种：以‘荸荠’杨梅果实为材料，设置三个生物学重复，每个重复4-6个果实，取果实果肉组织，迅速用液氮冻透，放至-80℃冰箱中保存。2、大肠杆菌BL21(DE3)PlysS表达宿主菌株：购于上海普洛麦格生物产品有限公司。3、pET-32a(+)载体：购于长沙优宝生物科技有限公司。4、槲皮素3-O-半乳糖苷标准品：购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。使用时用甲醇溶液溶解。5、UDP-半乳糖溶液：购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。配置10mg/mL的UDP-半乳糖溶液。称取10mgUDP-半乳糖，融于超纯水，定容至1mL，-20℃保存。6、氨苄青霉素母液(Amp+，500mM)：称取9.3mg氨苄青霉素钠Amp，溶于50mL灭菌超纯水，过滤除菌，分装小管，-20℃保存。7、500mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶基因，其特征在于，所述基因为MrUGT78D2，其核苷酸序列如SEQ:NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶基因，其特征在于，所述基因为MrUGT78D2，其核苷酸序列如SEQ:NO.1所示。


2.一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶基因，其特征在于，所述基因MrUGT78D2编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。


3.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鲜，任传宏，赵志康，解林峰，邢梦云，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33