一种强化毕赤酵母表达外源蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种强化毕赤酵母表达外源蛋白的方法，所述方法包括当Mut

【技术实现步骤摘要】
一种强化毕赤酵母表达外源蛋白的方法
本专利技术涉及发酵工程
，尤其涉及一种强化毕赤酵母表达外源蛋白的方法。
技术介绍
人源溶菌酶(hLYZ)作为一种天然的抑菌活力物质，在畜牧、医药及食品等行业具有潜在的应用价值。利用甲醇营养型重组毕赤酵母进行发酵是生产人源溶菌酶的有效手段，人源溶菌酶可全部分泌于发酵液中。在完成重组工程菌的构建以及摇瓶工艺优化的基础上，研究重点已转移到发酵罐规模发酵工艺的优化上。一般而言，利用重组毕赤酵母生产外源蛋白的发酵过程可分为细胞生长期和甲醇诱导期两个阶段。其中，细胞生长阶段的主要目的是以甘油为唯一碳源、短时间内获得高密度的毕赤酵母细胞。后续甲醇诱导阶段的主要目的则是采用适当的甲醇流加策略以实现外源蛋白的高效表达。近年来，大量研究表明利用重组毕赤酵母表达外源蛋白过程中，外源蛋白的表达能力与能否获取高密度且细胞骨架完整的重组毕赤酵母细胞直接相关。为此，在细胞生长阶段，通过实施合适的甘油流加策略，可以在短时间内获得高密度的细胞骨架完整的毕赤酵母细胞。甘油流加速度过慢、细胞生长速度缓慢；甘油流加速度过快则会出现“葡萄糖效应(Crabtreeeffect)”，导致乙醇等有毒代谢副产物的积累。尽管积累的乙醇在进入到甲醇诱导期时，也会被完全消耗殆尽，但其在细胞生长阶段长时间/高浓度的积累，破坏了重组菌的细胞骨架，不可逆地抑制了AOX相关编码基因的转录水平，导致毕赤酵母无法正常表达、严重影响毕赤酵母表达外源蛋白的发酵稳定性。甘油流加速度控制策略主要有定速流加、指数流加、DO-stat等。以上的甘油流加控制策略的实施都是为了实现“氧气充足-甘油受限”的生长环境，通过甘油受限可以在短时间内获得高密度细胞和抑制有毒副产物的积累(乙醇等)。但是，当毕赤酵母细胞长时间处于氧气充足的环境下，大量的活性氧(ROS)会在细胞中积累，当累积的ROS攻破细胞抗氧化防御系统时，可引起脂质、蛋白质、核酸等结构的损伤，进而导致细胞生长能力丧失甚至凋亡。据此，Xiao等人[XiaoAF,ZhouXS,ZhouLetal.ApplMicrobiolBiotechnol,2006,72:837-844]适时地提出添加昂贵抗氧化剂(抗坏血酸等)的方式、以消除胞内ROS的积累胁迫，最终恢复了细胞的代谢活性和外源蛋白合成效率。但是采用该方法存在需要加入昂贵的抗氧化剂的缺点，会在无形之中增加发酵生产的成本的同时，由于没有在线检测抗坏血酸浓度的设备和模型，无法实时反馈抗坏血酸的匮乏情况。通过多变量聚类分析可知，在细胞生长阶段，如果细胞结构和功能受到了不可逆转的损伤，即使诱导阶段的甲醇浓度控制在最优水平也不能实现外源蛋白的高效表达。
技术实现思路
本专利技术旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本专利技术提供一种强化毕赤酵母表达外源蛋白的方法，目的是确保细胞在短时间内高速生长的同时，有效抑制细胞内ROS的积累胁迫。基于上述目的，本专利技术提供了一种强化毕赤酵母表达外源蛋白的方法，所述方法包括当MutS型毕赤酵母的发酵进入甘油流加阶段时，间歇性控制甘油流加工艺参数使细胞在ROS快速积累胁迫生长环境和ROS未积累胁迫生长环境之间循环4-6次，所述ROS快速积累胁迫生长环境中发酵液的溶解氧浓度为20-40％，甘油浓度0-1g/L，维持4-5h；所述ROS未积累胁迫生长环境中发酵液的溶解氧浓度为～0％，甘油浓度为2-5g/L，维持0.5-1.5h。作为一种优选的实施方式，所述间歇性控制甘油流加工艺参数使细胞在ROS快速积累胁迫生长环境和ROS未积累胁迫生长环境之间循环5次，所述ROS快速积累胁迫生长环境中发酵液的溶解氧浓度为20-40％，甘油浓度0-1g/L，维持4.5h；所述ROS未积累胁迫生长环境中发酵液的溶解氧浓度为～0％，甘油浓度为2-5g/L，维持1h。作为一种优选的实施方式，在甘油流加结束后，继续培养直至发酵液中残留的甘油完全耗尽，之后在发酵液中流加含有甲醇的诱导培养基启动甲醇诱导培养，甲醇诱导培养结束后，MutS型毕赤酵母的发酵结束。作为一种优选的实施方式，所述ROS快速积累胁迫生长环境是通过基于溶解氧电极在线监测溶解氧浓度进行调控甘油流加速度的调控方法得到的。作为一种优选的实施方式，所述调控方法为初始发酵培养基中的甘油耗尽时，启动甘油流加控制程序，预设溶解氧浓度的设定值为30％，当溶解氧浓度高于设定值时，增大甘油流加速度；当溶解氧浓度低于设定值时，减小甘油流加速度。所述ROS快速积累胁迫生长环境中甘油的流加速度采用如下计算公式得到：其中，YX/S＝0.40，YX/S是细胞对甘油的得率；μset＝0.15l/h，μset是细胞比生长速度的设定值；X0＝14.00g/L，X0是甘油流加开始时的细胞浓度；t0是甘油流加的开始时间；tf是甘油流加的结束时间；DO是发酵液中溶解氧浓度；DO*是发酵液中溶解氧浓度的设定值；KC＝0.08，KC为调整参数。作为一种优选的实施方式，所述ROS快速积累胁迫生长环境中溶解氧浓度的控制方法为利用工控机和其内置的AD-DA数据接口/转化卡，驱动程序可调式蠕动泵，以所述计算公式在发酵液中流加甘油。作为一种优选的实施方式，所述ROS未积累胁迫生长环境是基于离线测量的甘油浓度并通过手动控制甘油流加速度的方法得到的。作为一种优选的实施方式，所述MutS型毕赤酵母在初始发酵培养基中的接种量为初始发酵培养基总体积的15-25％。作为一种优选的实施方式，在发酵起始培养时，通气速度为3-5vvm，温度为29-31℃，pH为5.8-6.2。本专利技术的有益效果：(1)采用本专利技术的方法，在细胞生长阶段结束时，ROS的浓度处于最低水平，实现了短时间内获得大量的结构完整、功能健全的毕赤酵母细胞。(2)采用本专利技术的方法，在甘油流加阶段，维持细胞生长所需的甘油处于最低水平。(3)采用本专利技术的方法，诱导期内毕赤酵母细胞的甲醇代谢途径中相关酶(AOX、FLD和FDH)的比活性得到了大幅地增强。(4)利用本专利技术可以将毕赤酵母适应甲醇诱导环境的时间缩短一半。(5)采用本专利技术的方法，当采用相同的甲醇诱导策略时，人源溶菌酶的活性达到了2.45×105IU/mL的最高水平，约为传统的“ROS快速积累胁迫”生长环境的2倍。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为对比例1中MutS型毕赤酵母在甘油流加过程中的甘油浓度以及DO变化情况；其中，─：在线溶解氧浓度；■：甘油浓度；图2为对比例1中MutS型毕赤酵母在甘油流加过程中的ROS以及细胞浓度曲线；其中，●：细胞浓度；▲：ROS浓度；图3为对比例2中MutS型毕赤酵母在甘油流加过程中的甘油浓度以及DO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种强化毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括当Mut

【技术特征摘要】
1.一种强化毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括当MutS型毕赤酵母的发酵进入甘油流加阶段时，间歇性控制甘油流加工艺参数使细胞在ROS快速积累胁迫生长环境和ROS未积累胁迫生长环境之间循环4-6次，所述ROS快速积累胁迫生长环境中发酵液的溶解氧浓度为20-40％，甘油浓度0-1g/L，维持4-5h；所述ROS未积累胁迫生长环境中发酵液的溶解氧浓度为～0％，甘油浓度为2-5g/L，维持0.5-1.5h。


2.根据权利要求1所述强化毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述间歇性控制甘油流加工艺参数使细胞在ROS快速积累胁迫生长环境和ROS未积累胁迫生长环境之间循环5次，所述ROS快速积累胁迫生长环境中发酵液的溶解氧浓度为20-40％，甘油浓度0-1g/L，维持4.5h；所述ROS未积累胁迫生长环境中发酵液的溶解氧浓度为～0％，甘油浓度为2-5g/L，维持1h。


3.根据权利要求1所述强化毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，在甘油流加结束后，继续培养直至发酵液中残留的甘油完全耗尽，之后在发酵液中流加含有甲醇的诱导培养基启动甲醇诱导培养，甲醇诱导培养结束后，MutS型毕赤酵母的发酵结束。


4.根据权利要求1所述强化毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述ROS快速积累胁迫生长环境是通过基于溶解氧电极在线监测溶解氧浓度进行调控甘油流加速度的调控方法得到的。


5.根据权利要求4所述强化毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述调控方法为初始发酵培养基中的甘油耗尽时，启动甘油流加控制程序，预...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾禄强，李腾，黄阿根，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32