多环大环内酰胺类化合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及多环大环内酰胺类化合物及其制备方法和应用。本发明专利技术构建了生产多环大环内酰胺类化合物的工程菌S001

【技术实现步骤摘要】
多环大环内酰胺类化合物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及多环大环内酰胺类化合物及其制备方法和应用，属于天然药物化学与微生物


技术介绍

[0002]新型耐药菌和致病菌的出现不断威胁人类的健康和经济的发展，新活性和新作用机制抗生素的研发迫在眉睫。天然产物是新抗生素研发的重要资源，多环特特拉姆酸大环内酰胺 (polycyclic tetramate macrolactam，PoTeM)是具有特特拉姆酸(tetramic acid)结构单元及多环体系的大环内酰胺类化合物。PoTeMs的结构多样性主要体现在多环体系的不同，如5/6/5三环、 5/5/6三环和5/5双环等，此外，细胞色素P450酶催化的羟基化、羰基化和环氧化等后修饰进一步丰富了其结构的多样性。PoTeMs具有抗细菌、抗真菌、抗原虫、抗溃疡、抗肿瘤和抑制Ⅲ型分泌系统毒力蛋白分泌等多种生物活性。
[0003]传统抗生素的作用机制主要是抑菌或杀菌，而抑制革兰阴性致病菌Ⅲ型分泌系统毒力蛋白分泌的作用机制主要是通过靶向毒力蛋白，使致病菌丧失毒力、致病能力和生存竞争能力，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.多环大环内酰胺类化合物，其特征在于，结构式如式(I)或(II)所示：2.一种用于生产权利要求1所述多环大环内酰胺类化合物的工程菌，其特征在于，所述工程菌的代谢产物中含有权利要求1所述的多环大环内酰胺类化合物。3.如权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌中含有负责PoTeMs多烯骨架合成的聚酮
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非核糖体肽合酶基因cbmA，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；负责多环体系中间五元环合成的黄素依赖性氧化还原酶基因cbmB，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；负责多环体系外侧五元环合成的黄素依赖性氧化还原酶基因cbmC，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；负责多环体系内侧六元环合成的NADPH依赖性氧化还原酶基因OX4，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；负责氧化后修饰的细胞色素P450酶基因sgr810或细胞色素P450酶基因sshg_05717，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。4.权利要求2所述工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：(1)以链霉菌Streptomyces sp.S10的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到序列两端分别引入NdeI和SpeI酶切位点的黄素依赖性氧化还原酶基因cbmB和黄素依赖性氧化还原酶基因cbmC基因片段；以产酶溶杆菌Lysobacter enzymogenes C3的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到序列两端分别引入NdeI和SpeI酶切位点的NADPH依赖性氧化还原酶OX4基因片段；以链霉菌Streptomyces albus J1074基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到序列两端分别引入NdeI和SpeI酶切位点的细胞色素P450酶基因sshg_05717基因片段；上述四个PCR产物经NdeI和SpeI双酶切后，得到cbmB
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NdeI/SpeI、cbmC
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NdeI/SpeI、OX4
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NdeI/SpeI和sshg_05717
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NdeI/SpeI片段；人工合成细胞色素P450酶基因sgr810并克隆至载体片段pMV
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AMP中得到质粒pMV
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sgr810，该质粒经NdeI和SpeI双酶切后得到sgr810
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NdeI/SpeI片段；cbmB
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NdeI/SpeI、cbmC
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NdeI/SpeI、OX4
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NdeI/SpeI、sgr810
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NdeI/SpeI和sshg_05717
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NdeI/SpeI分别与载体片段pUC
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kasOp*/ermEp*
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NdeI/SpeI经连接酶连接，连接产物分别化转大肠杆菌DH5α感受态细胞，经验证和提取后获得质粒pUC
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cbmB、pUC
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cbmC、pUC
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OX4、pUC
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sgr810和pUC
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sshg_05717；(2)质粒pUC
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cbmB和pUC
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OX4分别经MfeI和SpeI双酶切后获得cbmB
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MfeI/SpeI和OX4
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MfeI/SpeI片段；质粒pUC
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cbmC、pUC
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sgr810和pUC
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sshg_05717分别经XbaI和PstI双酶切后获得cbmC
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XbaI/PstI、sgr810
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XbaI/PstI和sshg_05717
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XbaI/PstI片段；将cbmB
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MfeI/SpeI、cbmC
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XbaI/PstI和载体片段pSET5035
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MfeI/PstI经连接酶连接，得到质粒pSET5035
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cbmB
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C；OX4
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MfeI/SpeI、sgr810
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XbaI/PstI和载体片段pSET5035
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MfeI/PstI经连接酶连接，得到质粒pSET5035
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OX4
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sgr810；OX4
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MfeI/SpeI、sshg_05717
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XbaI/PstI和载体片段
pSET5035
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MfeI/PstI经连接酶连接，得到质粒pSET5035
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OX4
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sshg_05717；(3)质粒pUC
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cbmA经MfeI和SpeI双酶切后获得cbmA
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MfeI/SpeI；质粒pSET5035
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cbmB
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C经XbaI和PstI双酶切后获得cbmB
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C
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XbaI/PstI片段；cbmA
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MfeI/SpeI、cbmB
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C
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XbaI/PstI和载体片段pSET5035
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MfeI/PstI经连接酶连接，得到质粒pSET5035
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cbmA
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B
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C；(4)质粒pSET5035
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cbmA
‑
B
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C经MfeI和SpeI双酶切后获得cbmA
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B
‑
C
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MfeI/SpeI片段；质粒pSET5035
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OX4
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sgr810和pSET5035
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OX4
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sshg_05717分别经XbaI和PstI双酶切后获得OX4
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sgr810
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XbaI/PstI和OX4
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sshg_05717
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XbaI/PstI片段；cbmA
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B
‑
C
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MfeI/SpeI、OX4
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sgr810
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XbaI/PstI和载体片段pSET5035
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MfeI/PstI经连接酶连接，得到表达载体pSET5035
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cbm
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OX4
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sgr810；cbmA
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B
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C
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MfeI/SpeI、OX4
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sshg_05717
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XbaI/PstI和载体片段pSET5035
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MfeI/PstI经连接酶连接，得到表达载体pSET5035
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cbm
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OX4
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sshg_05717；(5)将步骤(4)得到的表达载体pSET5035
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cbm
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OX4
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sgr810和pSET5035

【专利技术属性】
技术研发人员：李瑶瑶，高翔，颜雅倩，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：