IDH1 R132H基因突变实时荧光定量PCR检测试剂及方法技术

本发明专利技术涉及IDH1R132H基因突变实时荧光定量PCR检测试剂及方法，该检测试剂包括引物和探针；引物包括序列如SEQ ID No.1所示的正向引物和序列如SEQ ID No.2所示的反向引物；探针包括序列如SEQ ID No.3所示的野生型探针和序列如SEQ ID No.4所示的突变型探针；野生型探针的5’端标记有VIC荧光基团，野生型探针的3’端标记有MGB淬灭基团；突变型探针的5’端标记有FAM荧光基团，野生型探针的3’端标记有MGB淬灭基团。本发明专利技术能够实现IDH1R132H基因突变的实时荧光定量PCR检测，检测速度快，判断方便，检测敏感性好，对检测样本要求低。

【技术实现步骤摘要】
IDH1R132H基因突变实时荧光定量PCR检测试剂及方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及IDH1R132H基因突变实时荧光定量PCR检测试剂及方法。
技术介绍
IDH(isocitratedehydrogenase，异柠檬酸脱氢酶)是三羧酸循环中关键限速酶，其作用是促进异柠檬酸转化为α-酮戊二酸(α-KG)及CO2，为细胞新陈代谢提供能量及生物合成的前体物质。IDH基因突变多见于中枢神经系统肿瘤且多存在于低级别胶质瘤，亦见于继发性胶母细胞瘤，其中80％以上的IDH基因突变发生在IDH1基因132位密码子中精氨酸和组氨酸的转换(cgt>cat)，IDH1R132H基因突变不仅减少了IDH1蛋白酶的分泌，同时降低了该酶的活性，使得胞内细胞低氧诱导因子-1α含量增加，α-KG合成减少，最终促进肿瘤的生长及增殖。目前，IDH1R132H突变常用的检测方法包括免疫组织化学(IHC)法及Sanger测序法。其中，IHC法是根据抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂来定性或定量地确定组织细胞内抗原的方法。但IHC法主观性强，不同医生的判读结果可能不一致，可能出现一些弱阳性或非特异性着色而导致无法判读。Sanger测序法的原理是在作为扩增原料的四种脱氧核苷酸(dNTP)中混入限量的缺少延伸所需3’-OH基团的双脱氧核苷酸(ddNTP)作为链终止剂，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处结束，然后对所得的一系列核苷酸进行电泳检测，从而获得可见的DNA碱基序列。但Sanger测序法对组织要求高，操作复杂，敏感性仅为10～20％，容易检测失败或造成污染。聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增DNA或RNA的分子生物学技术，具有扩增速度快等优点。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR步骤通常包括：双链模板DNA解离呈单链，单链与引物配对结合，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，按碱基互补配对和半保留复制原理，合成新的与模板DNA链互补的半保留复制链，如此重复循环能够将基因扩增放大几百万倍目前也存在利用PCR进行基因突变检测的方法，但大多检测敏感性不高，现有技术中一些文献公开了采用巢式PCR来提高检测敏感性，但巢式PCR操作复杂，且容易放大污染，对检测样本要求高。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供IDH1R132H基因突变实时荧光定量PCR检测方法，能够实现IDH1R132H基因突变的实时荧光定量PCR检测，检测速度快，判断方便，检测敏感性好，对检测样本要求低，成本低。为实现本专利技术的目的，本专利技术提供了IDH1R132H基因突变实时荧光定量PCR检测试剂，其包括引物和探针；引物包括序列如SEQIDNo.1所示的正向引物和序列如SEQIDNo.2所示的反向引物；探针包括序列如SEQIDNo.3所示的野生型探针和序列如SEQIDNo.4所示的突变型探针；野生型探针的5’端标记有VIC荧光基团，野生型探针的3’端标记有MGB淬灭基团；突变型探针的5’端标记有FAM荧光基团，野生型探针的3’端标记有MGB淬灭基团。其中，SEQIDNo.1为5’-cggcttgtgagtggatgg-3’；SEQIDNo.2为5’-acgacctgatccccataagc-3’；SEQIDNo.3为5’-catcataggtcgtcatg-3’；SEQIDNo.4为5’-catcataggtcatcatg-3’。进一步的技术方案是，IDH1R132H基因突变实时荧光定量PCR检测试剂还包括dNTP、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和ddH2O，PCR反应缓冲液包含Mg2+离子。为实现本专利技术的目的，本专利技术还提供了IDH1R132H基因突变实时荧光定量PCR检测方法，其包括以下步骤：步骤1：在上述任一方案所述的IDH1R132H基因突变实时荧光定量PCR检测试剂中加入待检测的DNA，进行扩增反应和实时荧光检测；步骤2：根据扩增曲线判读突变情况。进一步的技术方案是，在步骤2中，根据扩增曲线获得Ct值，根据Ct值判断突变情况。与现有技术相比，本专利技术能够取得以下有益效果：本专利技术的IDH1R132H基因突变实时荧光定量PCR检测试剂及由其实现的IDH1R132H基因突变实时荧光定量PCR检测方法，能够提高检测速度，判断方便，改善检测敏感性，对检测样本要求低，同时检测可以在全封闭状态下进行，无污染风险。具体地，本专利技术根据IDH1R132H的野生基因及突变基因设计了1对引物及2条探针，用于对提取的组织DNA进行扩增，根据扩增曲线获得Ct值即可判断突变情况，操作简单，成本低。本专利技术的IDH1R132H基因突变实时荧光定量PCR检测试剂和方法适用于疾病诊断目的和非疾病诊断目的IDH1R132H基因突变检测。附图说明图1是本专利技术实施例敏感性测试的扩增曲线图。图中A为突变型质粒含量分别为1％的待测样品的扩增曲线，B为突变型质粒含量分别为2％的待测样品的扩增曲线，C为突变型质粒含量分别为5％的待测样品的扩增曲线，D为突变型质粒含量分别为10％的待测样品的扩增曲线，E为突变型质粒含量分别为15％的待测样品的扩增曲线。以下结合附图以及具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。具体实施方式本实施例为了实现IDH1R132H基因突变的实时荧光定量PCR检测方法，根据IDH1基因的野生型及突变型设计了IDH1R132H基因突变的实时荧光定量PCR检测试剂。IDH1基因的野生型质粒序列如SEQIDNo.5所示，IDH1基因的R132H突变型质粒序列如SEQIDNo.6所示。SEQIDNo.5为agctatgatttaggcatagagaatcgtgatgccaccaacgaccaagtcaccaaggatgctgcagaagctataaagaagcataatgttggcgtcaaatgtgccactatcactcctgatgagaagagggttgaggagttcaagttgaaacaaatgtggaaatcaccaaatggcaccatacgaaatattctgggtggcacggtcttcagagaagccattatctgcaaaaatatcccccggcttgtgagtggatgggtaaaacctatcatcataggtcgtcatgcttatggggatcaggtcgt；SEQIDNo.6为agctatgatttaggcatagagaatcgtgatgccaccaacgaccaagtcaccaaggatgctgcagaagctataaagaagcataatgttggcgtcaaatgtgccactatcactcctgatgagaagagggttgaggagttcaagttgaaacaaatgtggaaatcaccaaatggcaccatacgaaatattctgggtggcacggtcttcagagaagccattatctgcaaa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.IDH1 R132H基因突变实时荧光定量PCR检测试剂，其特征在于包括引物和探针；/n所述引物包括序列如SEQ ID No.1所示的正向引物和序列如SEQ ID No.2所示的反向引物；SEQ ID No.1为5’-cggcttgtgagtggatgg-3’；SEQ ID No.2为5’-acgacctgatccccataagc-3’；/n所述探针包括序列如SEQ ID No.3所示的野生型探针和序列如SEQ ID No.4所示的突变型探针；SEQ ID No.3为5’-catcataggtcgtcatg-3’；SEQ ID No.4为5’-catcataggtcatcatg-3’；/n所述野生型探针的5’端标记有VIC荧光基团，所述野生型探针的3’端标记有MGB淬灭基团；所述突变型探针的5’端标记有FAM荧光基团，所述野生型探针的3’端标记有MGB淬灭基团。/n

【技术特征摘要】
1.IDH1R132H基因突变实时荧光定量PCR检测试剂，其特征在于包括引物和探针；
所述引物包括序列如SEQIDNo.1所示的正向引物和序列如SEQIDNo.2所示的反向引物；SEQIDNo.1为5’-cggcttgtgagtggatgg-3’；SEQIDNo.2为5’-acgacctgatccccataagc-3’；
所述探针包括序列如SEQIDNo.3所示的野生型探针和序列如SEQIDNo.4所示的突变型探针；SEQIDNo.3为5’-catcataggtcgtcatg-3’；SEQIDNo.4为5’-catcataggtcatcatg-3’；
所述野生型探针的5’端标记有VIC荧光基团，所述野生型探针的3’端标记有MGB淬灭基团；所述突变型探针的5’端标记有FAM荧光基团，所述野生型探针的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈志强，陈昂，吴小延，文礼娟，
申请(专利权)人：中山市博爱医院，
类型：发明
国别省市：广东;44