一种普瑞巴林人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种普瑞巴林人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。普瑞巴林人工半抗原的分子结构式如式(Ⅰ)，普瑞巴林人工抗原的分子结构式如式(Ⅱ)。所述应用是所述普瑞巴林人工抗原在制备抗普瑞巴林抗体中的应用。本发明专利技术的普瑞巴林人工半抗原最大程度地保留了普瑞巴林的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的普瑞巴林人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗普瑞巴林抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1:90000，可用于对普瑞巴林进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。检测和免疫分析。检测和免疫分析。

【技术实现步骤摘要】
一种普瑞巴林人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物化工
，具体涉及一种普瑞巴林人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]普瑞巴林作为一种抗惊厥药，主要用于成人癫痫部分性发作、糖尿病性神经痛、疱疹后神经痛和焦虑障碍治疗。它是一种GABA类似物，能降低谷氨酸、去甲肾上腺素、P物质和降钙素基因相关肽等神经递质的释放。最近的研究发现其在治疗烟草、酒精和苯二氮卓类药物成瘾方面也能起到一定的作用。
[0003]虽然目前对普瑞巴林滥用的报道非常罕见，但是仍需引起注意尤其是那些有物质依赖倾向的患者。若服用超出推荐剂量的普瑞巴林或采用错误的用药方式(如直肠给药或鼻内给药)，较易出现药物滥用症状。Skopp等人曾报道过一例患者在滥用普瑞巴林后出现反常激越、焦虑发作和异常思维。目前对于普瑞巴林滥用并没有特定的解毒剂，而快速撤药后会出现失眠、恶心、头痛、腹泻等不适。因此，对建立快速、灵敏、准确的检测技术提出了迫切需求。
[0004]目前，对普瑞巴林的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、质谱法(MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速、准确的要求。
[0005]免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制造出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体。但是，由于包括普瑞巴林在内的大多数小分子化合物(分子量小于1000)，不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，故小分子物质被称为半抗原。通过适当的化学修饰，在半抗原分子结构的某个位置上带上端部为活性基团的连接臂，再与大分子载体结合，生成半抗原
‑
载体偶联物(即人工抗原)，人工抗原可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种普瑞巴林人工半抗原，该普瑞巴林人工半抗原最大程度地保留了普瑞巴林的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇。
[0007]一种普瑞巴林人工半抗原，其分子结构式如(Ⅰ)所示：
[0008][0009]本专利技术还提供了该普瑞巴林人工半抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0010](1)将普瑞巴林溶于甲醇中，再加入浓硫酸，于68℃下回流搅拌反应24小时，反应产物经碳酸氢钠固体中和，转干，再用四氢呋喃提取，得略黄色油状物A。
[0011](2)将略黄色油状物A与顺丁烯二酸酐按摩尔比1:2～3混合于二氯甲烷中，再加入4
‑
二甲氨基吡啶，在室温下搅拌反应20小时，反应产物经纯化水洗涤，取有机相，干燥、过滤得棕黄色油状物；
[0012]将上述黄色油状物通过薄层色谱(TLC)分离得淡黄色油状物，即普瑞巴林半抗原Ⅰ；TLC：层析液为95％乙醇：二氯甲烷：1,4
‑
二氧六环：氨水＝8:10:1:1，产物R
f
＝0.4。
[0013]通过上述方法，在普瑞巴林的N位上引入连接臂，在该修饰位点上引入连接臂能最大程度地保留普瑞巴林的特征结构。
[0014]与采用一般的饱和链烃作为连接臂相比，本专利技术所采用的连接臂中含有共轭双键结构，使得该半抗原具备紫外吸收特性，不仅能够使原本在254nm光波下不显色的普瑞巴林变成在该光波下显色的普瑞巴林人工半抗原，大大降低了该人工半抗原提纯的难度；而且可使该人工半抗原的特异性增强，在溶液中保持构象稳定，提高所得到的人工抗原II的免疫特性。
[0015]本专利技术还提供了一种普瑞巴林人工抗原，其分子结构式如(Ⅱ)所示：
[0016][0017]其中，BSA为牛血清蛋白。
[0018]本专利技术还提供了一种所述普瑞巴林人工抗原的制备方法，包括：通过活泼酯法使所述普瑞巴林人工半抗原Ⅱ与牛血清蛋白结合，获得所述普瑞巴林人工抗原Ⅱ。
[0019]具体地，包括以下步骤：
[0020](a)将所述普瑞巴林人工半抗原Ⅰ、与N
‑
羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺以摩尔比为1∶1.35～1.5∶1.35～1.5溶解于N，N
‑
二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液；
[0021](b)将上清液滴加到牛血清蛋白溶液中，混合液于4℃下静置过夜，经pH＝12.00的0.5％碳酸钠水溶液和磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析、离心取上清液，获得普瑞巴林人工抗原Ⅱ。
[0022]本专利技术中牛血清蛋白溶液是将牛血清蛋白溶于磷酸根离子浓度为0.01mol/L，pH＝7.2～7.4的磷酸盐缓冲液中制成的。
[0023]步骤(b)中，所述牛血清蛋白溶液的浓度为20mg/ml，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶5。
[0024]本专利技术选用的牛血清蛋白(BSA)作为大分子载体，与其他载体蛋白相比，具有以下优点：
①
BSA具有583个氨基酸残基，较容易与普瑞巴林半抗原发生偶联，可制得不同偶联比的普瑞巴林人工抗原，且具有较高的免疫原性；
②
BSA经济实惠，成本低；
③
BSA的化学性质比较稳定，在酸性和弱碱性的环境下也有很好的溶解度和稳定性，适合长期储存。
[0025]本专利技术还提供了所述普瑞巴林人工抗原Ⅱ在制备抗普瑞巴林抗体中的应用。
[0026]本专利技术还提供了一种抗普瑞巴林抗体，是由所述普瑞巴林人工抗原经动物免疫得到的、可与普瑞巴林发生特异性免疫反应的球蛋白。
[0027]本专利技术还提供了所述抗普瑞巴林抗体在检测普瑞巴林中的应用。
[0028]试验发现，将所述普瑞巴林人工抗原免疫新西兰白兔，获得的免疫血清的效价为1:90000。表明本专利技术的普瑞巴林人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗普瑞巴林抗体，该抗普瑞巴林抗体可用于普瑞巴林的免疫检测和分析。
[0029]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0030]本专利技术的普瑞巴林人工半抗原最大程度地保留了普瑞巴林的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的普瑞巴林人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗普瑞巴林抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1:90000，可用于对普瑞巴林进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
附图说明
[0031]图1为本专利技术普瑞巴林人工抗原的制备流程图；
[0032]其中，DMAP表示4
‑
二甲氨基吡啶，NHS表示N
‑
羟基琥珀酰亚胺，DCC表示二环己基碳二亚胺，BSA表示牛血清蛋白，DMF表示N,N
‑
二甲基甲酰胺，下同；
[0033]图2为普瑞巴林人工本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种普瑞巴林人工半抗原，其特征在于，其分子结构式如(Ⅰ)所示：2.权利要求1所述普瑞巴林人工半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将普瑞巴林溶于甲醇，加入浓硫酸，于68℃下搅拌反应24h，反应产物经调碱、蒸干、提取得略黄色油状产物A；(2)将上一步所获略黄色油状产物A与顺丁烯二酸酐按摩尔比1:2～3混合于二氯甲烷中，于室温下搅拌反应20h，反应产物经洗涤、干燥、过滤、转干后，再经薄层色谱分离得淡黄色油状产物，即普瑞巴林人工半抗原Ⅰ。3.一种普瑞巴林人工抗原，其特征在于，其分子结构式如(Ⅱ)所示：其中，BSA为牛血清蛋白。4.权利要求3所述普瑞巴林人工抗原的制备方法，其特征在于，包括：通过活泼酯法使权利要求1所述的普瑞巴林人工半抗原与牛血清蛋白结合，获得如权利要求3所述的普瑞巴林人工抗原Ⅱ。5.如权利要求4所述普瑞巴林人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将所...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵越水，王镇，
申请(专利权)人：杭州同舟生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：