一种山羊源牛疱疹病毒1型毒株及其应用制造技术

本发明专利技术属于动物传染病防治技术领域，具体涉及一种山羊源牛疱疹病毒1型毒株BoHV‑1/Goat/CHN/HB01/2016。该毒株分离自腹泻山羊的粪便，在体外MDBK细胞中，通过病毒毒价、一步生长曲线、噬斑大小等结果，证明该毒株的复制能力减弱。病毒的基因组全长133,971bp，GC含量高达71％，通过gC片段的比对分析，该病毒属于BoHV‑1.1亚型，其中在gB、gK、gM、VP8蛋白中存在特异性突变，可能与毒株的致病力相关。该毒株攻毒牛后，通过临床症状评分、鼻腔排毒和肺脏组织病理变化，表明毒株致病力减弱。本发明专利技术为研究BoHV‑1的致病力和跨物种传播机制奠定重要基础，同时也为临床上的疫苗研制提供了重要材料。

【技术实现步骤摘要】
一种山羊源牛疱疹病毒1型毒株及其应用
本专利技术属于动物传染病防治
，具体涉及一种山羊源牛疱疹病毒1型毒株。
技术介绍
牛疱疹病毒1型(Bovineherpesvirus-1，BoHV-1)属于疱疹病毒科(Herpesviridae)α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)水痘病毒属(Varicellovirus)，也称为牛传染性鼻气管炎病毒(Infectionbovinerhinotracheitisvirus,IBRV)。BoHV-1是牛传染性鼻气管炎病的病原，能引起牛发生一种急性、热性、接触性传染病，主要临床表现为上呼吸道及气管炎、黏膜炎、高热、流鼻汁、呼吸困难、流产等。BoHV-1感染后可引起机体免疫抑制，继发细菌或其他病毒感染，造成严重的肺炎，称为牛呼吸道疾病综合征(Bovinerespiratorydiseasecomplex，BRDC)，又称“运输热”，给世界养牛业造成了巨大损失。BoHV-1主要感染牛和水牛，也有血清学证据表明感染其他偶蹄动物。在土耳其山羊群中BoHV-1的中和抗体阳性率为20.9％；在伊朗绵羊中和抗体阳性率为10.7％-28.4％；埃及绵羊和山羊BoHV-1感染的血清阳性率分别为23.8％和27.6％；在加拿大，绵羊BoHV-1的中和抗体阳性率为10.8％；在韩国中和试验确定山羊中BoHV-1血清阳性率为13.7％。研究表明：相比于绵羊，山羊和牛之间的感染存在显着相关性，因此可将山羊视为BoHV-1的潜在贮藏宿主。病毒宿主的多样性对控制和预防该病增加了难度，目前很少有关于山羊源BoHV-1毒株的分离和鉴定，这极大限制了BoHV-1在山羊与牛之间跨物种传播机制的研究。本专利技术人通过病毒的分离鉴定，首次从腹泻山羊粪便中获得一株山羊源BoHV-1，体内和体外均验证该病毒毒力天然减弱，这为研究BoHV-1的致病和跨物种传播机理以及疫苗的研制提供了一种良好的天然材料。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种山羊源牛疱疹病毒1型(Bovineherpesvirus-1，BoHV-1)毒株，该毒株不仅可作为BoHV-1致病和跨物种传播机理研究的对象，同时也能作为疫苗研制更好的材料，对牛疱疹病毒的防控具有重要的意义。本专利技术的技术方案如下所述：申请人于2016年5月从湖北省黄冈市某山羊养殖场，从腹泻山羊的粪便中分离鉴定及纯化，得到一株BoHV-1毒株，申请人将其命名为牛疱疹病毒1BoHV-1/Goat/CHN/HB01/2016，于2020年12月11日保藏于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：V202092。在体外MDBK细胞中，通过病毒空斑、一步生长曲线、病毒毒价等结果，证明该毒株的复制能力低于参考毒株BoHV-1Cooper。提取病毒的全基因组进行高通量测序，获得一条完整的病毒基因组序列，基因组全长133,971bp，GC含量高达71％。通过gC片段的比对分析，该病毒属于BoHV-1.1亚型。与参考毒株Cooper比较，该毒株在gB、gK、gM、VP8蛋白中存在特异性突变，这些突变可能与毒株的致病力相关。攻毒牛后，通过临床症状评分、鼻腔排毒和肺脏组织病理变化，表明本专利技术毒株致病力低于参考毒株Cooper。本专利技术具有以下优点：首次从腹泻山羊粪便样本中分离鉴定获得牛疱疹病毒1型毒株，该毒株表现出毒力致弱，从而为研究BoHV-1病毒的致病力和跨物种传播机制奠定重要基础，同时也为临床上安全性更好的牛传染性鼻气管炎病疫苗研制提供了重要材料。更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。附图说明图1：是鉴定山羊腹泻样本中BoHV-1的gG和TK基因的PCR胶图图谱。附图标记说明：1-3泳道是检测TK基因，4-6泳道是检测gG基因。1和4泳道是山羊腹泻样本，2和5泳道是参考毒株Cooper株作为阳性对照，3和6泳道是阴性对照，7泳道是DL2000DNAmarker。图2：是BoHV-1HB01毒株形成的细胞病变图谱，标尺为400μm，附图标记说明：图2A是山羊源HB01毒株形成的细胞病变图谱，图2B是阴性对照图谱。图3：是BoHV-1HB01病毒粒子在电子显微镜下观察的形态图谱。图4：是BoHV-1HB01病毒传代过程中的毒价稳定性。图5：是BoHV-1HB01病毒生长曲线图，以0.1MOI感染病毒。图6：是BoHV-1HB01病毒形成的空斑大小比较。图7：是BoHV-1HB01病毒gB基因进化树。图8：是BoHV-1HB01病毒gC基因进化树。图9：是BoHV-1HB01病毒攻毒牛后体温变化。图10：是BoHV-1HB01病毒攻毒牛后临床症状评分变化。图11：是BoHV-1HB01病毒攻毒牛后日增重。图12：是BoHV-1HB01病毒攻毒牛后检测鼻腔排毒。图13：是BoHV-1HB01病毒攻毒牛后肺脏组织病理学结果。附图标记说明：图13A是BoHV-1HB01毒株攻毒后牛肺脏病理学观察结果，图13B是BoHV-1Cooper毒株攻毒后牛肺脏病理学观察结果，图13中的C是接种DMEM牛肺脏病理学观察结果，图谱中的标尺为50μm。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1：毒株的分离和鉴定1.毒株的分离采集黄冈市某山羊养殖场腹泻山羊的粪便样本，低温保存快速运输至实验室。样本进行8000r/min离心10min，取200μL上清液，使用DNA提取试剂盒(购自北京全式金有限公司)提取样本中的病毒DNA，参考BoHV-1毒株序列(基因组GenBank登录号为AJ004801)设计两对引物gG-F/R、TK-F/R进行PCR鉴定。引物由商业生物公司进行合成，各引物序列如表1所示。所得目标条带符合预期(图1)，鉴定山羊腹泻样本中BoHV-1为阳性。表1：检测临床样本中BoHV-1的gG和TK基因的引物在长满MDBK细胞的6孔板中，加入上述PCR鉴定BoHV-1阳性的病料上清液400μL，在37℃感作60min。弃去上清液，并无菌PBS润洗3次，补加含2％胎牛血清的DMEM培养基2mL，置于37℃含5％CO2的培养箱中培养。在接种病料18-24h后可观察到明显的细胞病变，细胞变圆、折光度变高，聚集一团呈葡萄球状，(图2A)，阴性对照细胞没有出现明显变化(图2B)。2.毒株的鉴定将该病毒培养上清液按照上述方法，提取DNA后进行gG和TK片段的PCR鉴定，得到预期的明显条带。PCR产物使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)进行回收纯化，然后连接至TOPO载体(购自北京艾德莱有限公司)，将连接产物全部转化DH5α大肠杆菌感受态，然后接种至氨苄青霉素抗性的普通培养板上，37℃过夜培养后，挑选合适的单菌落，进行PCR鉴定后将阳性的单克隆送至商业生物公司进行测序。获得的gG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus-1，BoHV-1)毒株，命名为BoHV-1/Goat/CHN/HB01/2016，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202092。/n

【技术特征摘要】
1.一种牛疱疹病毒1型(Bovineherpesvirus-1，BoHV-1)毒株，命名为BoHV-1/Goat/CHN/HB01/2016，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V202092。


2.如权利要求1所述的牛疱疹病毒1型毒株，其特征在于：该毒株分离自腹泻山羊粪便，是一株山羊源牛疱疹病毒1型毒株。
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【专利技术属性】
技术研发人员：郭爱珍，朱杰，陈曦，王琛，彭清洁，陈颖钰，胡长敏，陈建国，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42