一种重组寨卡病毒减毒株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种重组寨卡病毒减毒株，所述重组寨卡病毒减毒株至少存在以下一种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸，还公开了重组寨卡病毒cDNA、重组寨卡病毒表达蛋白、重组表达载体及重组寨卡病毒减毒株在制备重组寨卡病毒疫苗中的应用。本发明专利技术所制备得到的重组寨卡病毒减毒株能够在体外细胞水平稳定复制，实验表明其具有明显的减毒特征，同时该重组寨卡病毒减毒株具有良好的免疫原性，其诱导的抗体可抑制寨卡病毒的感染，具有良好的保护作用，预测其可作为减毒活疫苗进行后续临床研究及应用。

【技术实现步骤摘要】
一种重组寨卡病毒减毒株及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种重组寨卡病毒减毒株及其制备方法和应用。
技术介绍
寨卡病毒(Zikavirus,ZIKV)是一种蚊媒传播的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科。大多数人感染ZIKV通常是无症状的或仅引起轻微症状，如皮疹，发烧，关节痛和结膜炎。2013年，法属波利尼西亚爆发了大规模的ZIKV感染，随后蔓延至美洲，太平洋，东南亚和非洲的80多个国家和地区。ZIKV的感染与严重的神经系统症状有关，例如婴儿的小头畸形和成人的格林巴利综合症。尽管疫情已逐渐下降，但全球仍有近61个国家散布着埃及伊蚊的有效传播媒介，这些国家仍存在爆发寨卡疫情的巨大隐患。当前，没有临床可用的ZIKV疫苗与药物。几种候选疫苗正在接受临床前和临床试验，但均未获得临床许可。因此，仍需要安全有效的ZIKV疫苗。ZIKV基因组编码一个大的多聚蛋白，该蛋白被剪切成三个结构蛋白和七个非结构蛋白。包膜蛋白(envelopeprotein，E)介导病毒附着并进入宿主细胞。大多数候选疫苗主要针对E蛋白，因为E蛋白包含中和抗体的主要表位。然而，由于黄病毒E蛋白在氨基酸序列和结构上的相似性，针对一种黄病毒E蛋白的抗体可能会通过Fcγ受体(FcγR)介导途径增强自身或另一种黄病毒的感染即抗体依赖增强效应(antibody-dependentenhancedeffect,ADE)，特别是当抗体没有中和活性或处于中和浓度以下时。非结构蛋白1(Non-structuralprotein1,NS1)在病毒复制，致病性和免疫逃逸中起着重要作用。靶向NS1的抗体和T细胞已显示具有对ZIKV感染的保护作用。重要的是，NS1不存在于病毒颗粒外壳上，因此NS1特异性抗体不太可能引起ADE效应。因此，理想的ZIKV疫苗应可诱导针对E和NS1蛋白的保护性免疫反应。减毒活疫苗有可能引发针对多种抗原(包括E和NS1)的保护性免疫。目前，已经使用ZIKV的prM和E基因替换了黄病毒(yellowfevervirus,YFV)或日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)的相应基因，制备了ZIKV减毒活疫苗，或者将ZIKV的E和NS1的编码序列去优化产生了复制能力减弱的ZIKV。衣壳蛋白中9个氨基酸的缺失或3'非翻译区(untranslationregion，UTR)中10个核苷酸的缺失减弱了ZIKV的致病性。敲除E或NS1蛋白的糖基化位点也可导致ZIKV减毒。但是，嵌合YFV或JEV的寨卡疫苗可能无法诱导ZIKVNS1特异性免疫应答，因为它们表达YFV或JEV的NS1蛋白。携带去优化的密码子或序列缺失的ZIKV减毒活疫苗可诱导针对E和NS1蛋白的免疫反应，但它们的生长能力通常在已批准用于疫苗生产的非洲绿猴Vero细胞等细胞系中显著降低。因此，研制可大量扩增的减毒活疫苗至关重要。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的之一在于提供一种重组寨卡病毒减毒株，该重组寨卡病毒减毒株具有较好的免疫原性，具有明显的减毒特征，且在Vero细胞中高滴度扩增。其可作为减毒活疫苗进行后续临床研究及应用。实现上述目的的具体技术方案如下：一种重组寨卡病毒减毒株，该重组寨卡病毒减毒株至少存在以下一种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸。在其中一些实施例中，上述重组寨卡病毒减毒株存在以下三种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸。在其中一些实施例中，上述重组寨卡病毒减毒株的cDNA的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，或如SEQIDNO.18所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，但能编码相同蛋白质的核苷酸序列。本专利技术的目的之二在于提供一种重组寨卡病毒cDNA，所述重组寨卡病毒减毒株的cDNA为野生型寨卡病毒cDNA且所编码蛋白中存在以下至少一种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸的核苷酸序列；或所述重组寨卡病毒cDNA的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，或如SEQIDNO.18所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，但能编码相同蛋白质的核苷酸序列。本专利技术的目的之三在于提供一种重组寨卡病毒表达蛋白。实现上述目的的具体技术方案如下：一种重组寨卡病毒表达蛋白，所述重组寨卡病毒表达蛋白为上述重组寨卡病毒株所表达的蛋白；或其为上述重组寨卡病毒cDNA翻译的蛋白。本专利技术的目的之四在于提供一种重组表达载体。实现上述目的的具体技术方案如下：一种重组表达载体，所述重组表达载体上插入有上述重组寨卡病毒cDNA；一种重组表达载体，所述重组表达载体上插入可用于表达上述重组寨卡病毒表达蛋白的基因。本专利技术的目的之五在于提供一种重组寨卡病毒减毒株的制备方法。实现上述目的的具体技术方案如下:(1)在野生型的寨卡病毒的NS2A和NS5之间插入了NS2A的3'区域到NS5的5'区域的片段，通过体外连接构建寨卡病毒cDNA克隆pVAX-GZ02-Intron；(2)以pVAX-GZ02-Intron为模板，以序列如SEQIDNO.14-SEQIDNO.15所示的引物对进行PCR获得5’UTR-optE片段，以序列如SEQIDNO.16-SEQIDNO.17所示的引物对进行PCR获得optNS1-NS2A片段；通过overlapPCR融合片段5’UTR-optE和片段optNS1-NS2A，得到5’UTR-NS2A片段，并将其连接得到携带重组寨卡病毒cDNA全长的重组克隆pVAX-GZ02；(3)将上述重组克隆pVAX-GZ02转染仓鼠肾细胞，拯救获得cDNA序列如SEQIDNO.18所示的重组寨卡病毒减毒株。在其中一些实施例中，上述pVAX-GZ02-Intron为通过overlapPCR技术构建了从5'UTR到NS2A的5'区域的片段，以及NS5的3'区域和3'UTR，在NS2A和NS5之间插入了NS2A的3'区域到NS5的5'区域的片段，通过体外连接构建而得；在其中一些实施例中，上述pVAX-GZ02-Intron的制备包括如下步骤：(1)以序列如SEQIDNO.1所示和SEQIDNO.2所示核苷酸片段为模板，以序列如SEQIDNO.3-SEQIDNO.4所示的引物对进行融合PCR获得插入内含子的optENS1片段；(2)将序列如SEQIDNO.5所示的野生型寨卡病毒A片段,序列如SEQIDNO.6所示B片段与线性化载体pVAX三片段同源重组，形成pVAX-AB质粒；(3)以pVAX-AB质粒作为模板，以序列如SEQIDNO.9-SEQIDNO.10所示的引物对进行P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组寨卡病毒减毒株，其特征在于，所述重组寨卡病毒减毒株至少存在以下一种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组寨卡病毒减毒株，其特征在于，所述重组寨卡病毒减毒株至少存在以下一种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸。


2.根据权利要求1所述的重组寨卡病毒减毒株，其特征在于，所述重组寨卡病毒减毒株存在以下三种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸。


3.根据权利要求1所述的重组寨卡病毒减毒株，其特征在于，所述重组寨卡病毒减毒株的cDNA的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，或如SEQIDNO.18所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，但能编码相同蛋白质的核苷酸序列。


4.一种重组寨卡病毒cDNA，其特征在于，所述重组寨卡病毒减毒株的cDNA为野生型寨卡病毒cDNA且所编码蛋白中存在以下至少一种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸的核苷酸序列；
或所述重组寨卡病毒cDNA的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，或如SEQIDNO.18所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，但能编码相同蛋白质的核苷酸序列。


5.一种重组寨卡病毒表达蛋白，其特征在于，其为权利要求1-3任一项所述重组寨卡病毒减毒株所表达的蛋白；或其为权利要求4所述重组寨卡病毒cDNA翻译的蛋白。


6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体上插入有如权利要求4所述的重组寨卡病毒cDNA，或所述重组表达载体上插入可用于表达权利要求5所述重组寨卡病毒表达蛋白的基因。


7.一种重组寨卡病毒减毒株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在野生型的寨卡病毒的NS2A和NS5之间插入了NS2A的3'区域到NS5的5'区域的片段，通过体外连接构建寨卡病毒cDNA克隆pVAX-GZ02-Intron；
(2)以pVAX-GZ02-Intron为模板，以序列如SEQIDNO.14-SEQIDNO.15所示的引物对进行PCR获得5’UTR-optE片段，以序列如SEQIDNO.16-SEQIDNO.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯立强，陈凌，叶贤苗，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44