一种高纯度NK细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术提供了一种用于分离培养高纯度NK细胞的试剂盒，它包含培养基1‑3，本发明专利技术还提供了一种高纯度NK细胞的分离培养方法。利用本发明专利技术提供的试剂盒及分离培养方法，可以高效获得满足临床使用的NK细胞，细胞数量多，纯度高、杀伤活性好，在同种异体NK回输方面具有突出优势，应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度NK细胞的分离培养方法本专利技术为申请日：2017年9月5日，申请号：201710791174.8，专利名称：一种高纯度NK细胞的分离培养方法的分案。
本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种高纯度NK细胞的分离培养方法。
技术介绍
自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)是机体重要的免疫细胞，作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其主要杀瘤效应，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。近年来，NK细胞因其细胞杀伤活性高，起效快，且不受MHC限制等优点，相对于αβT细胞，γδT细胞和CIK等其它用于免疫治疗的细胞NK细胞受到了更广泛的关注和临床应用。但是NK细胞数量较少，在外周血中仅占淋巴细胞的10％-15％，在脐带血中NK的含量更低，只有5％左右，正常人体外周血中和脐带血中NK细胞含量远远不能满足临床治疗的需要。NK细胞的数量和纯度是临床疗效的重要影响因素，NK细胞数量太少不能达到治疗的效果，纯度低则会影响对肿瘤的杀伤作用。尤其是临床上多采用健康供者的血液来制备NK，然后采用同种异体回输以达到治疗目的，这就对所回输NK细胞的纯度要求比较高，如果其中混入过多T细胞B细胞等杂细胞则会引起机体的排斥反应。因此，如何分离制备得到高质量高纯度的NK细胞成为其临床应用中亟待解决的问题。目前，国内外已经有大量的研究者进行了人NK细胞的培养和生物治疗方面的研究，但培养得到的NK细胞存在数量较少、或纯度较低、或杀伤活性低等问题，不能满足实际应用的需要。例如：公开号为CN102268405A的专利申请，报道了一种NK细胞体外活化扩增培养的方法，其培养过程中不仅需要添加饲养细胞，虽然可在体外大量扩增NK细胞，但是安全性问题和回输到体内后并无饲养层细胞，体内和体外环境的差异对NK细胞在体内的扩增和杀伤活性的影响是其无法回避的问题。公开号为CN104928242A的专利申请报道了一种NK细胞的培养方法，培养15天后，NK细胞仅扩增139.5倍，数量仍较少，而且杀伤活性较低。公开号为CN103627672A的专利申请报道的NK细胞体外培养方法，得到的培养产物中，NK细胞仅扩增102.81±94.06倍，而且采用传统的Ficoll法密度梯度离心法分离NK细胞，数量和纯度不佳。因此，急需对NK细胞的制备方法进一步改进，以制备高产量、高纯度、杀伤活性好的NK细胞。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有外周血/脐带血NK细胞体外分离、纯化、扩增方法的不足，提供一种高产量、高纯度NK细胞的分离培养方法。本专利技术提供了一种用于分离培养高纯度NK细胞的试剂盒，它包含培养基1-3；其中，培养基1是在无血清培养基中，添加终浓度为500-1000U/mL的IL-2、终浓度为30-50μg/mL的IL-15和终浓度为5-10％的添加物组成；培养基2是在无血清培养基中，添加终浓度为500-1000U/mL的IL-2组成；培养基3是在无血清培养基中，添加终浓度为500-1000U/mL的IL-2和终浓度为5-10％的添加物组成；其中，所述无血清培养基为淋巴细胞培养用无血清培养基；所述添加物为：自体血浆、胎牛血清或市售血清替代物。淋巴细胞培养用无血清培养基：即适合淋巴细胞生长的无血清培养基。自体血浆：指与所取NK细胞为同一个体的血浆；自体血浆作为NK细胞分离中的副产物，可用于后续的NK细胞活化培养。其中，所述淋巴细胞培养用无血清培养基为AIM-V培养基、X-VIVO15培养基、GT-T551H3培养基或Alys-505N培养基。其中，它包含培养基1-3；其中，培养基1是在无血清培养基中，添加终浓度为500U/mL的IL-2、终浓度为30μg/mL的IL-15和终浓度为10％的自体血浆组成；培养基2是在无血清培养基中，添加终浓度为500U/mL的IL-2组成；培养基3是在无血清培养基中，添加终浓度为500U/mL的IL-2和终浓度为5％的自体血浆组成。本专利技术还提供了一种高纯度NK细胞的分离培养方法，它使用了上述试剂盒，步骤如下：a、取人外周血或脐带血，利用RosetteSepEnrichmentCocktail富集NK细胞；b、Herceptin包被培养瓶，备用；c、对步骤a得到的NK细胞，加入培养基1，37℃下孵育30min，然后取未贴壁的细胞悬液转入步骤b已包被抗体的培养瓶中，培养；d、第3天，加入等体积培养基2，继续培养；第6天，加入培养基3，继续培养；每2天加入培养基2，培养至14天，即可。其中，步骤a中，富集方法如下：(1)取外周血或脐带血，抗凝后离心，吸取上清血浆灭活，再次离心；弃去沉淀，用PBS补充血浆的量，混匀；(2)按每毫升抗凝血加入RosetteSepTMEnrichmentCocktail50ul，混匀，室温孵育20分钟；(3)用PBS+2％FBS溶液重悬，混匀后加至淋巴分离液上，离心，收集白膜层细胞；然后用PBS+2％FBS溶液洗涤两次，收集细胞沉淀，即可。其中，步骤(1)中，抗凝后离心的条件为800g，8min；再次离心的条件为600g，10min。其中，步骤(1)中，灭活的方法为：56℃水浴30min。其中，步骤(2)中，离心的条件为：1200g，20min。其中，步骤b中，包被方法如下：PBS稀释Herceptin，至Herceptin浓度为20-50μg/mL，加入培养瓶中，使Herceptin均匀铺满底面，于37℃孵育2小时或4℃过夜；使用前用PBS清洗两次；优选地，Herceptin浓度为20μg/mL。本专利技术还提供了上述方法制备的NK细胞产物。本专利技术方法具有如下优点：1、本专利技术方法得到的NK细胞纯度高达98％以上，排除了T细胞，Treg细胞，B细胞的污染，对肿瘤细胞的杀伤活性高，可满足美国NHLBI(Nationalheart,lungandbloodInsititute)用于同种异体回输的标准(CD3-CD56+NK细胞达到90％以上，CD19+B细胞和CD3+T细胞低于5％)，不但可用于自体NK回输，也可以用于同种异体NK的回输。2、本专利技术方法不需要在整个培养阶段都添加多种活化因子，只在前三天活化诱导的时候加入IL15和IL2激活NK细胞，在后期的培养中只需维持IL2的浓度无需添加IL15，降低了培养成本，适用于临床大规模培养。3、本专利技术方法培养过程中不依赖于饲养细胞,提高了使用安全性，同时避免了回输后由于体内和体外环境的差异对NK细胞在体内的扩增和杀伤活性的影响。4、本专利技术方法分离纯化及体外扩增时间短；而且操作简单，减少了中间环节污染的可能性。因此，本专利技术提供的试剂盒及分离培养方法，可以从外周血或脐带血中高效获得满足本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.NK细胞三阶段使用的培养基组合，其特征在于，/n所述培养基组合包含培养基1、培养基2和培养基3，所述培养基2和培养基3不含IL-15,所述培养基1在NK细胞生长的前两天使用，所述培养基2在NK细胞生长的第3-5天和第8-14天使用，所述培养基3在NK细胞生长的第6天使用；/n所述培养基1是在无血清培养基中，添加终浓度为500U/mL的IL-2、终浓度为30μg/mL的IL-15和终浓度为10％的自体血浆组成；/n所述培养基2为终浓度为500U/mL的IL-2组成；/n所述培养基3为终浓度为500U/mL的IL-2和终浓度为5％的自体血浆组成。/n

【技术特征摘要】
1.NK细胞三阶段使用的培养基组合，其特征在于，
所述培养基组合包含培养基1、培养基2和培养基3，所述培养基2和培养基3不含IL-15,所述培养基1在NK细胞生长的前两天使用，所述培养基2在NK细胞生长的第3-5天和第8-14天使用，所述培养基3在NK细胞生长的第6天使用；
所述培养基1是在无血清培养基中，添加终浓度为500U/mL的IL-2、终浓度为30μg/mL的IL-15和终浓度为10％的自体血浆组成；
所述培养基2为终浓度为500U/mL的IL-2组成；
所述培养基3为终浓度为500U/mL的IL-2和终浓度为5％的自体血浆组成。


2.含有权利要求1所述的培养基组合的NK细胞的体系，其特征在于，所述NK细胞为经过RosetteSepTMEnrichmentCocktail法初步分离纯化而得的纯化NK细胞。


3.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述纯化NK细胞的CD3-CD56+NK细胞比率达到88.3％。


4.根据权利要求2所述的体系，其特征在于，所述纯化NK细胞与所述培养基1共存2天，得活化NK细胞。


5.根据权利要求4所述的体系，其特征在于，用培养基2替换培养基1，让所述活化NK细胞与所述培养基2在第3-5天共存，得扩增NK细胞。


6.根据权利要求5所述的体系，其特征在于，用培养基3替换培养基2，让所述扩增N...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨本艳姿，李雪莲，陈强，
申请(专利权)人：四川新生命干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51