一种免疫细胞NK的冻存液及其活性研究方法技术

本发明专利技术公开了一种免疫细胞NK的冻存液及其活性研究方法，包括免疫细胞NK的分离、细胞NK的无血清体外扩增、分析细胞NK的生长曲线、分析细胞NK表面抗原表达、分析细胞NK周期、免疫细胞NK的冻存及复苏、免疫细胞各项指标检测。无血清培养基悬浮培养体系，分离获得的免疫细胞NK具有较强的增殖能力，利用细胞冻存液1冻存的细胞复苏后，细胞活性在四种细胞冻存液中的细胞活性最高，在90%以上，流式细胞仪检测结果表明，冻存前的细胞与冻存复苏后的细胞的免疫表型无明显差异，均具有免疫细胞的免疫表型，流式细胞术检测细胞凋亡实验表明，细胞冻存液1冻存的细胞复苏后，晚期凋亡的细胞数最少，且未发生凋亡的细胞数最多。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫细胞NK的冻存液及其活性研究方法
本专利技术涉及一种免疫细胞NK的冻存液及其活性研究方法，具体为一种免疫细胞NK的冻存液及其活性研究方法，属于细胞研究

技术介绍
肿瘤是人类面临的共性问题，当前尚无有效治愈手段，极大影响了患者生活质量。血液肿瘤并发症多、治疗时间长、药物不良反应大、手术费高，带来较大的家庭压力、社会负担。NK细胞(Naturalkillercells)是人体防御肿瘤的第一道防线，在固有免疫系统具有重要的作用，不需要提前致敏就可以对肿瘤细胞进行直接杀伤。虽然现在NK细胞已经被用于肿瘤免疫的细胞治疗，并在临床治疗肿瘤(如白血病，巴瘤和黑色素瘤)有很好的效果；但不论对第三方细胞库，还是对配送和应用临床管理说，NK细胞的长期有效储存始终是一个问题。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于为了解决问题而提供一种免疫细胞NK的冻存液及其活性研究方法。本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：一种免疫细胞NK的冻存液及其活性研究方法，包括以下步骤：步骤一、免疫细胞NK的分离包括以下过程：（1）、在生物安全柜中，将外周血用电动助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml离心管中，设定离心参数升9降7，2000rmp，离心8min；（2）、外周血离心后先吸取上层血浆至50ml离心管中，取四个EP管，每管加入1.0ml血浆，水浴锅中56℃灭活30min，3000rpm离心10min，取上层血浆至洁净50ml离心管中，备用；（3）、用NA稀释血细胞，使得血细胞：NA为1:1。步骤二、细胞NK的无血清体外扩增包括以下步骤：（1）、免疫细胞的起始培养；离心收集全部细胞，用30mlNK培养液（里面添加自体血清1.5ml，5%）重悬，及加2mlNK扩增试剂，设定离心参数，升9降7，2000rpm，离心8min，倒弃剩余上清。用电动助吸器吸取15mlNK细胞培养液至离心管中，悬浮沉淀，吹打混匀后加入培养瓶中，加NK细胞培养液15ml离心管并转入培养瓶中，水平放置在37℃、7.5%的CO2培养箱中培养。（2）免疫细胞的无血清培养；细胞培养至第3天离心、换液、换瓶：收集细胞离心，1500转，5分钟。离心后的细胞沉淀加含5%自体血浆的NK细胞培养液30ml重悬，第4-6天，根据实际生长情况，进行添液，转移培养袋：第7天计数，细胞数量大于1*108，则加入4ml扩增试剂，如细胞数量在3~8*107则长至第8天再添加扩增试剂。加含5%自体血浆的NK细胞培养液使总细胞浓度在1.0*106Cell/m。培养液体积大于200ml或细胞数量大于1*108，则可以转移至培养袋培养；第8~11天每天观察，加含1%自体血浆的NK细胞培养液使得细胞浓度在1*106Cell/ml左右；第12~14天每天观察，添液使得细胞浓度在2*106Cell/ml左右。当细胞生长至所需数量时即可进行收集使用或冻存。一般情况下，建议13或14天收集细胞。步骤三、分析细胞NK的生长曲线。步骤四、分析细胞NK表面抗原表达。步骤五、分析细胞NK周期。步骤六、免疫细胞NK的冻存及复苏，实验组设置有四组免疫细胞NK的冻存实验和一组对照组，且五组实验分别冻存10天和30天。步骤七、免疫细胞各项指标检测。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤一中，混匀后均匀缓慢地加至相应的A液上层，形成完整的界面，设定离心参数升6降4，1600rpm，离心20min，吸弃第一层上清，小心轻柔地将第二层的白色细胞层吸至洁净50ml离心管中，各管中加NA，稀释混匀，定容至50ml/管，设定离心参数升9降7，2000rpm，离心8min，吸弃上清，加10mlNA/管，重悬细胞。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤三中，采用台盼蓝染色法检测细胞活性，并绘制出相应的细胞生长曲线。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤四中，采用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD56、CD8抗原。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤五中，采用流式细胞仪检测细胞周期。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤六中，四组实验组和一组对照组分别是：（1）、细胞冻存液1：A液：20%的20%人血白蛋白，10%的15%右旋糖酐/5%葡萄糖注射液；B液：31.25%勃脉力A（复方电解质注射液），31.25%的5%葡萄糖/0.45%氯化钠注射液，7.5%DMSO，配置完毕后分装至15ml离心管，放置-20℃待用；（2）、细胞冻存液2：采用脐带组织冻存的B液，购置后分装至15ml离心管，放置-20℃待用；（3）、友康冻存液：购置后分装至15ml离心管，放置-20℃待用；（4）、亘诺冻存液：购置后分装至15ml离心管，放置-20℃待用；（5）、对照组：新鲜细胞。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤七中，可以通过核细胞计数、活细胞检测、集落培养、免疫细胞检测等对NK免疫细胞进行各项指标检测。本专利技术的有益效果是：该免疫细胞NK的冻存液及其活性研究方法设计合理，应用无血清培养基悬浮培养体系，分离获得的免疫细胞NK具有较强的增殖能力，利用细胞冻存液1冻存的细胞复苏后，细胞活性在四种细胞冻存液中的细胞活性最高，在90%以上，流式细胞仪检测结果表明，冻存前的细胞与冻存复苏后的细胞的免疫表型无明显差异，均具有免疫细胞的免疫表型，流式细胞术检测细胞凋亡实验表明，细胞冻存液1冻存的细胞复苏后，晚期凋亡的细胞数最少，且未发生凋亡的细胞数最多。附图说明图1为本专利技术流程示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。请参阅图1，一种免疫细胞NK的冻存液及其活性研究方法，包括以下步骤：步骤一、免疫细胞NK的分离包括以下过程：（4）、在生物安全柜中，将外周血用电动助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml离心管中，设定离心参数升9降7，2000rmp，离心8min；（5）、外周血离心后先吸取上层血浆至50ml离心管中，取四个EP管，每管加入1.0ml血浆，水浴锅中56℃灭活30min，3000rpm离心10min，取上层血浆至洁净50ml离心管中，备用；（6）、用NA稀释血细胞，使得血细胞：NA为1:1。步骤二、细胞NK的无血清体外扩增包括以下步骤：（2）、免疫细胞的起始培养；离心收集全部细胞，用30mlNK培养液（里面添加自体血清1.5ml，5%）重悬，及加2mlNK扩增试剂，设定离心参数，升9降7，2000rpm，离心8min，倒弃剩余上清。用电动助吸器吸取15mlNK细胞培养液至离心管中，悬浮沉淀，吹打混匀后加入培养瓶中，加NK细胞培养液15ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫细胞NK的冻存液及其活性研究方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤一、免疫细胞NK的分离包括以下过程：/n（1）、在生物安全柜中，将外周血用电动助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml离心管中，设定离心参数升9降7，2000rmp，离心8min；/n（2）、外周血离心后先吸取上层血浆至50ml离心管中，取四个EP管，每管加入1.0ml血浆，水浴锅中56℃灭活30min，3000rpm离心10min，取上层血浆至洁净50ml离心管中，备用；/n（3）、用NA稀释血细胞，使得血细胞：NA为1:1。/n步骤二、细胞NK的无血清体外扩增包括以下步骤：/n（1）、免疫细胞的起始培养；/n离心收集全部细胞，用30ml NK培养液（里面添加自体血清1.5ml，5%）重悬，及加2mlNK扩增试剂，设定离心参数，升9降7，2000rpm，离心8min，倒弃剩余上清。用电动助吸器吸取15mlNK细胞培养液至离心管中，悬浮沉淀，吹打混匀后加入培养瓶中，加NK细胞培养液15ml离心管并转入培养瓶中，水平放置在37℃、7.5%的CO2培养箱中培养；/n（2）免疫细胞的无血清培养；/n细胞培养至第3天离心、换液、换瓶：收集细胞离心，1500转，5分钟。离心后的细胞沉淀加含5%自体血浆的NK细胞培养液30ml重悬，第4-6天，根据实际生长情况，进行添液，转移培养袋：第7天计数，细胞数量大于1*108，则加入4ml扩增试剂，如细胞数量在3~8*107则长至第8天再添加扩增试剂。加含5%自体血浆的NK细胞培养液使总细胞浓度在1.0*106Cell/m。培养液体积大于200ml或细胞数量大于1*108，则可以转移至培养袋培养；第8~11天每天观察，加含1%自体血浆的NK细胞培养液使得细胞浓度在1*106Cell/ml左右；第12~14天每天观察，添液使得细胞浓度在2*106Cell/ml左右。当细胞生长至所需数量时即可进行收集使用或冻存。一般情况下，建议13或14天收集细胞；/n步骤三、分析细胞NK的生长曲线；/n步骤四、分析细胞NK表面抗原表达；/n步骤五、分析细胞NK周期；/n步骤六、免疫细胞NK的冻存及复苏，实验组设置有四组免疫细胞NK的冻存实验和一组对照组，且五组实验分别冻存10天和30天；/n步骤七、免疫细胞各项指标检测。/n...

【技术特征摘要】
1.一种免疫细胞NK的冻存液及其活性研究方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、免疫细胞NK的分离包括以下过程：
（1）、在生物安全柜中，将外周血用电动助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml离心管中，设定离心参数升9降7，2000rmp，离心8min；
（2）、外周血离心后先吸取上层血浆至50ml离心管中，取四个EP管，每管加入1.0ml血浆，水浴锅中56℃灭活30min，3000rpm离心10min，取上层血浆至洁净50ml离心管中，备用；
（3）、用NA稀释血细胞，使得血细胞：NA为1:1。
步骤二、细胞NK的无血清体外扩增包括以下步骤：
（1）、免疫细胞的起始培养；
离心收集全部细胞，用30mlNK培养液（里面添加自体血清1.5ml，5%）重悬，及加2mlNK扩增试剂，设定离心参数，升9降7，2000rpm，离心8min，倒弃剩余上清。用电动助吸器吸取15mlNK细胞培养液至离心管中，悬浮沉淀，吹打混匀后加入培养瓶中，加NK细胞培养液15ml离心管并转入培养瓶中，水平放置在37℃、7.5%的CO2培养箱中培养；
（2）免疫细胞的无血清培养；
细胞培养至第3天离心、换液、换瓶：收集细胞离心，1500转，5分钟。离心后的细胞沉淀加含5%自体血浆的NK细胞培养液30ml重悬，第4-6天，根据实际生长情况，进行添液，转移培养袋：第7天计数，细胞数量大于1*108，则加入4ml扩增试剂，如细胞数量在3~8*107则长至第8天再添加扩增试剂。加含5%自体血浆的NK细胞培养液使总细胞浓度在1.0*106Cell/m。培养液体积大于200ml或细胞数量大于1*108，则可以转移至培养袋培养；第8~11天每天观察，加含1%自体血浆的NK细胞培养液使得细胞浓度在1*106Cell/ml左右；第12~14天每天观察，添液使得细胞浓度在2*106Cell/ml左右。当细胞生长至所需数量时即可进行收集使用或冻存。一般情况下，建议13或14天收集细胞；
步骤三、分析细胞NK的生长曲线；
步骤四、分析细胞NK表面抗原表达；
步骤五、分析细胞NK周期；
步骤六、免疫细胞NK的冻存及复苏，实验组设置有四组免疫细胞NK的冻存实验和...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雯雯，陈艳普，凡苗振，袁浩，
申请(专利权)人：河南省银丰生物工程技术有限公司，银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41