一株产纤维素酶的芽孢杆菌菌株筛选及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株产纤维素酶的芽孢杆菌菌株筛选及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术从动物粪便中筛选到了一株枯草芽孢杆菌，其在摇瓶水平上发酵生产纤维素酶活力达118.67U/mL，并且具备良好的传代稳定性。利用所述枯草芽孢杆菌生产纤维素酶的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一株产纤维素酶的芽孢杆菌菌株筛选及其应用
本专利技术涉及一株产纤维素酶的芽孢杆菌菌株筛选及其应用，属于生物工程

技术介绍
饲料益生菌除去本身的益生特性还能够通过产出各种化学物质，对动物消化吸收和肠道健康起到积极的作用。例如，针对动物难以吸收饲料中富含的粗纤维引起的腹泻，饲用益生菌能够生产纤维素酶，将动物不能直接吸收的粗纤维转化为动物机体易吸收利用的单糖，促进动物吸收，丰富其营养价值。因此，纤维素酶在饲料中有极大的应用。与传统微生物代谢改造或发酵优化方法相比，利用饲用益生菌发酵生产纤维素酶，既能够降低成本、保护环境，特定的物质能够得到更高的产量，益生菌又能够很好的定植在肠道，不会对动物机体造成任何损害，且能够生产有益物质、丰富肠道菌群，促进了动物的健康，对于现代饲料产业具有重要的现实意义和应用价值。曲霉和木霉是纤维素酶主要的高产菌株，但其需要通过复杂的基因过程手段改造和优化，如组成型过表达转录因子，能够有效的促成纤维素酶和半纤维素酶的生成，酶活可达90.38IU/mL，但其成本和操作难度较高，而且纤维素酶的生产通常会受到菌体生长以及纤维素诱导及碳源的阻遏，所以极大的阻遏其工业化生产纤维素酶，不适于工业化。从而，研究者将研究转向了操作更简单的益生菌，以期通过益生菌来达到纤维素酶的高产。目前产纤维素酶的芽孢杆菌报道较多，如李豪等从川南地区腐殖质土壤中分离筛选得到一株高产纤维素酶的枯草芽孢杆菌，并对其进行发酵条件优化，最终该菌种通过3天的发酵最高产酶水平可达到85.48U/mL(李豪等高产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及产酶特性研究.中国畜牧兽医.2019,46(03):711-8)。但是其发酵时间仍较长、产酶水平仍无法很好适应工业化的生产需求。
技术实现思路
为了解决目前纤维素酶产量低或生产效率低、操作难度大问题，本专利技术从动物粪便中筛选得到了一株枯草芽孢杆菌，其能够高效生产纤维素酶，快速分解纤维素，并且其本身所具备的益生功能也能有利于动物肠道的健康。本专利技术的第一个目的是提供一株产纤维素酶的枯草芽孢杆菌BacillussubtilisFMMEZK002，已于2021年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCM2021168，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。本专利技术提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，已于2021年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2021168。本专利技术提供了一种菌剂，所述菌剂含有所述枯草芽孢杆菌。在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。本专利技术提供了一种生产纤维素酶的方法，利用所述枯草芽孢杆菌生产纤维素酶。在一种实施方式中，将培养至对数生长期的枯草芽孢杆菌添加至反应体系中，并调节OD600为0.02～0.05。在一种实施方式中，反应体系中含有氯化钠、牛肉膏和蛋白胨。在一种实施方式中，所述发酵体系中含有牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。在一种实施方式中，在25-35℃，150-250rpm下培养。在一种实施方式中，反应时间不低于48h。本专利技术提供了所述菌株在生产纤维素酶中的应用。本专利技术提供了所述菌株在制备饲料中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术的枯草芽孢杆菌BacillussubtilisFMMEZK002具有较好的传代稳定性，在传代数代之后，其纤维素酶的生产能力均能够稳定在一定水平；在摇瓶水平上发酵生产纤维素酶活力达118.67U/mL，且具备良好的传代稳定性。将其应用于饲料的制备中，能够降低成本、保护环境，且益生菌能够很好的定植在肠道，促进动物的健康，对于现代饲料产业具有重要的现实意义和应用价值。本专利技术发酵生产纤维素酶的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。生物材料保藏本专利技术所提供的枯草芽孢杆菌，分类命名为BacillussubtilisFMMEZK002，已于2021年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2021168，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。附图说明图1为枯草芽孢杆菌的菌落形态图。图2为枯草芽孢杆菌BacillussubtilisFMMEZK002的生长曲线。图3为枯草芽孢杆菌在摇瓶水平发酵过程纤维素酶活力及菌体浓度变化曲线图。具体实施方式(1)培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)筛选培养基(g/L)：CMC-Na10，(NH4)2SO44，蛋白胨1，MgSO4·7H2O0.5，KH2PO41，121℃灭菌15min；固体活化培养基(g/L)：氯化钠5，牛肉膏10，蛋白胨10，琼脂20，蒸馏水1.0L。液体种子培养基(g/L)：氯化钠5，牛肉膏10，蛋白胨10，蒸馏水1.0L。液体发酵培养基(g/L)：氯化钠5，牛肉膏10，蛋白胨10，蒸馏水1.0L。(2)纤维素酶的测定：按照行标QB2583-2003，采用羧甲基纤维素酶(CMC)酶活性测定法测定羧甲基纤维素酶酶活。酶活力单位规定：60℃条件下，以1mL纤维素酶粗酶液在1min内水解CMC成1μg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位。发酵液预处理：于4℃，5000rpm下离心10min，上清液即为粗酶液。在25mL试管中加入0.4mL浓度为1％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液，再加入0.4mL粗酶液，空白管不加酶液，60℃精确反应30min，取出后加入0.5mLDNS溶液，迅速100℃沸水浴10min，快速冷却至室温后定容至5mL，利用紫外线分光光度计测定吸光值A540，计算酶活。纤维素酶葡萄糖标准曲线的绘制：精确称取分析纯无水葡萄糖0.5g，以蒸馏水配置成0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14mg/mL的葡萄糖标准溶液。吸取各浓度标准溶液2.5mL，分别置于5只试管，以水代替葡萄糖溶液作空白对照，各加入2.5mLDNS溶液，100℃水浴10min，取出用流水迅速冷却至室温。再用蒸馏水定容至5mL，充分摇匀后，在波长540nm测定各管中吸光值。以各浓度的标准葡萄糖浓度作横坐标，吸光值作纵坐标绘制标准曲线。酶活力计算公式：X＝(W×N×1000×12.5)/(κ×T×M)(式中：X，酶活力(U/mL)；W，测得的吸光度值(试验组减去空白组)；N，酶样所稀释的倍数，此时N＝1；κ，葡萄糖标准曲线的斜率，为2.9407；T，反应时间，此时T＝30min；M，酶样体积，此时M＝0.4mL；1000，mg转化成μg；12.5为样品稀释倍数。)CMC底物溶液：称羧甲基纤维素钠(CMC—Na)1g，用磷酸盐缓冲液(pH＝6)定容至100mL。121℃灭菌25min，4℃保存。磷酸盐缓冲液(pH＝6)：磷酸氢二钠21.04g，磷酸二氢钠4.26g，配制完成后标定溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已于2021年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021168。/n

【技术特征摘要】
1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，已于2021年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2021168。


2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌。


3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。


4.一种生产纤维素酶的方法，其特征在于，利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌生产纤维素酶。


5.根据权利要求4所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈修来，赵阔，刘立明，高聪，刘佳，郭亮，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32