一种生物印迹复合膜及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种生物印迹复合膜及其制备方法，属于生物印迹膜制备领域。该方法包括：步骤一：金黄色葡萄球菌模板的制备；步骤二：N‑丁二酰‑壳聚糖的制备；步骤三：印迹聚二甲基硅氧烷‑N‑丁二酰‑壳聚糖生物印迹复合膜的制备；步骤四：印迹聚二甲基硅氧烷‑N‑丁二酰‑壳聚糖生物印迹复合膜的1H,1H,2H,2H‑全氟辛基三乙氧基硅烷修饰。该方法制备的生物印迹复合膜对金黄色葡萄球菌的捕获效率可高达85.35％，对其它常见5种食源性致病菌吸附效率与空白对比无差异。

【技术实现步骤摘要】
一种生物印迹复合膜及其制备方法
本专利技术属于生物印迹膜制备领域，具体涉及一种分离富集样品中金黄色葡萄球菌的1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷修饰聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖生物印迹复合膜及其制备方法。
技术介绍
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)是一种典型的危险食源性和人畜共患病原体，广泛存在于自然环境中，可导致全球范围的食品相关疾病暴发。从轻微的皮肤和软组织感染到心内膜炎、慢性骨髓炎、肺炎或菌血症，金黄色葡萄球菌引起的感染多样，严重甚至可引起死亡。在许多国家，金黄色葡萄球菌仍然是导致医疗保健相关感染的最常见的医院病原体之一，并给医疗保健相关支出带来额外负担。此外，由于金黄色葡萄球菌在高盐浓度(高达15％)和高温(需要超过80℃30min才能完全杀灭)下的顽强生存能力，同样给社会和畜牧业造成了巨大的危害和经济损失。因此，快速、准确地检测金黄色葡萄球菌对食品安全和人类健康具有重要意义。目前对金黄色葡萄球菌的常见检测方法包括国家标准GB4789.10-2016规定的传统分离培养鉴定法，免疫学检测方法和分子生物学检测方法等。(1)传统分离培养鉴定法是金黄色葡萄球菌检测的“金标准”，该方法计数可靠，可以准确的鉴定金黄色葡萄球菌并确定其浓度，但劳动强度大，耗时长，通常需要1周左右才能得到结果；(2)免疫学检测方法中，酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)方法最为常见，该方法主要通过抗原与抗体的特异性结合反应实现对致病菌的检测，但该方法需要增菌和反复的孵育过程，且抗体制备繁琐，反应敏感性低，长期稳定性和生物活性的维持能力较差，限制了免疫程序的可靠性；(3)分子生物学检测方法中，常规聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)方法应用最为广泛，该方法通过扩增目标菌的基因序列实现对致病菌的检测，具有高灵敏度和特异性，在一定程度上能够满足灵敏检测的要求，但该方法同样需要较长时间的前增菌过程，且仪器的复杂性和对技术人员的高要求使得PCR并不适合POCT(point-of-care)检测，更不用说可能因为PCR试剂中DNA污染而导致的假阳性结果。因此，如何在短时间内实现对病原菌的灵敏检测，又不过分依赖设备就成为新一代检测技术发展的重点。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种生物印迹复合膜及其制备方法，该膜基于细菌模板的印迹产生与金黄色葡萄球菌大小形貌一致的孔穴，通过进一步在其表面修饰1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷增加了捕获的特异性，能够实现对样品中金黄色葡萄球菌的高效、特异性分离捕获。本专利技术首先提供一种生物印迹复合膜的制备方法，包括：步骤一：金黄色葡萄球菌模板的制备将载玻片进行亲水处理，然后将载玻片的亲水表面用金黄色葡萄球菌均匀涂布静置，使细菌沉降至载玻片表面，去除多余的液体，得到金黄色葡萄球菌模板；步骤二：N-丁二酰-壳聚糖的制备将含有壳聚糖和琥珀酸酐的二甲基亚砜溶液加热搅拌后，经过过滤、洗涤，得到的固体放入去离子水中，调节PH为10～12，沉淀得到N-丁二酰-壳聚糖固体；步骤三：印迹聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖生物印迹复合膜的制备将聚二甲基硅氧烷预聚体A、交联剂B和润滑剂混合，得到聚二甲基硅氧烷预聚体混合液，将步骤二得到的N-丁二酰-壳聚糖溶解于去离子水中，再与聚二甲基硅氧烷预聚体混合液混合，得到混合物均匀涂布于载玻片表面进行预固化处理，然后将步骤一制备的金黄色葡萄球菌模板印于聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖复合物上静置，得到印迹聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖生物印迹复合膜；步骤四：印迹聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖生物印迹复合膜的1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷修饰将步骤三得到的印迹聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖生物印迹复合膜放置在容器中，在容器底部加入1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷密闭加热，使1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷均匀地沉积在薄膜表面，得到生物印迹复合膜。优选的是，所述的步骤一的亲水处理具体为：将载玻片在去离子水中超声处理，然后使用去离子水冲洗，分别用乙醇、丙酮处理玻片，重复上述步骤，用氮气吹干表面，将载玻片放入食人鱼溶液中，并在水浴中加热，冷却后用去离子水洗涤，氮气吹干备用。优选的是，所述步骤一中食人鱼溶液体积配比为H2SO4:H2O2＝7:3。优选的是，所述步骤一中所用金黄色葡萄球菌浓度为1.0*109cfu·mL-1。优选的是，所述步骤二中含有壳聚糖和琥珀酸酐的二甲基亚砜溶液中壳聚糖和琥珀酸酐的质量比为1：1。优选的是，所述步骤三中聚二甲基硅氧烷预聚体A和交联剂B质量比是10:1。优选的是，所述步骤三中N-丁二酰-壳聚糖与聚二甲基硅氧烷预聚体混合液的质量比为(1-5)：1000。优选的是，所述步骤三中预固化条件是50～90℃，1～3min。优选的是，所述步骤四中密闭加热条件为120～140℃，加热时间为2～4h。本专利技术还提供上述制备方法得到的生物印迹复合膜。本专利技术的有益效果本专利技术提供一种生物印迹复合膜及其制备方法，该方法首先使用琥珀酸酐在二甲基亚砜溶液中经由开环反应制备N-丁二酰-壳聚糖，结合聚二甲基硅氧烷组分在高效作用条件下制备混合液，预固化处理成复合膜。另一方面通过自然沉降法制备了金黄色葡萄球菌的细菌模板，通过压印的方式将细菌模板印迹到复合膜表面，然后揭除细菌模板，获得可特异性识别金黄色葡萄球菌的生物印迹复合膜，最后通过气相沉积法在其表面修饰1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷以增强其捕获的特异性，通过对金黄色葡萄球菌的富集研究发现N-丁二酰-壳聚糖与聚二甲基硅氧烷的最佳质量比为4:1000，由此制备的生物印迹复合膜对金黄色葡萄球菌的捕获效率可高达85.35％，对其它常见5种食源性致病菌吸附效率与空白对比无差异。附图说明图1为本专利技术实施例4中制备的生物印迹复合膜的实物图。图2为本专利技术实施例6中不同用量N-丁二酰-壳聚糖制备生物印迹复合膜对金黄色葡萄球菌捕获后的平板计数结果。图3为本专利技术生物印记复合膜的制备及分离捕获金黄色葡萄球菌示意图(a.金黄色葡萄球菌模板的制备；b.印迹聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖复合膜的制备；c.1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷的修饰及其对金黄色葡萄球菌的分离捕获)。具体实施方式本专利技术首先提供一种生物印迹复合膜的制备方法，如图3所示，包括：步骤一：金黄色葡萄球菌模板的制备在制作细菌模板之前，将标准级显微镜载玻片进行亲水处理，所述的亲水处理方法优选为：首先，将载玻片在去离子水中进行超声处理，所述的处理时间优选为15min，所述的载玻片规格优选为25mm×75mm，然后使用去离子水冲洗3次，再分别用乙醇、丙酮处理玻片，重复上述步骤，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物印迹复合膜的制备方法，其特征在于，包括：/n步骤一：金黄色葡萄球菌模板的制备/n将载玻片进行亲水处理，然后将载玻片的亲水表面用金黄色葡萄球菌均匀涂布静置，使细菌沉降至载玻片表面，去除多余的液体，得到金黄色葡萄球菌模板；/n步骤二：N-丁二酰-壳聚糖的制备/n将含有壳聚糖和琥珀酸酐的二甲基亚砜溶液加热搅拌后，经过过滤、洗涤，得到的固体放入去离子水中，调节PH为10～12，沉淀得到N-丁二酰-壳聚糖固体；/n步骤三：印迹聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖生物印迹复合膜的制备/n将聚二甲基硅氧烷预聚体A、交联剂B和润滑剂混合，得到聚二甲基硅氧烷预聚体混合液，将步骤二得到的N-丁二酰-壳聚糖溶解于去离子水中，再与聚二甲基硅氧烷预聚体混合液混合，得到混合物均匀涂布于载玻片表面进行预固化处理，然后将步骤一制备的金黄色葡萄球菌模板印于聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖复合物上静置，得到印迹聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖生物印迹复合膜；/n步骤四：印迹聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖生物印迹复合膜的1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷修饰/n将步骤三得到的印迹聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖生物印迹复合膜放置在容器中，在容器底部加入1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷密闭加热，使1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷均匀地沉积在薄膜表面，得到生物印迹复合膜。/n...

【技术特征摘要】
1.一种生物印迹复合膜的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一：金黄色葡萄球菌模板的制备
将载玻片进行亲水处理，然后将载玻片的亲水表面用金黄色葡萄球菌均匀涂布静置，使细菌沉降至载玻片表面，去除多余的液体，得到金黄色葡萄球菌模板；
步骤二：N-丁二酰-壳聚糖的制备
将含有壳聚糖和琥珀酸酐的二甲基亚砜溶液加热搅拌后，经过过滤、洗涤，得到的固体放入去离子水中，调节PH为10～12，沉淀得到N-丁二酰-壳聚糖固体；
步骤三：印迹聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖生物印迹复合膜的制备
将聚二甲基硅氧烷预聚体A、交联剂B和润滑剂混合，得到聚二甲基硅氧烷预聚体混合液，将步骤二得到的N-丁二酰-壳聚糖溶解于去离子水中，再与聚二甲基硅氧烷预聚体混合液混合，得到混合物均匀涂布于载玻片表面进行预固化处理，然后将步骤一制备的金黄色葡萄球菌模板印于聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖复合物上静置，得到印迹聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖生物印迹复合膜；
步骤四：印迹聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖生物印迹复合膜的1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷修饰
将步骤三得到的印迹聚二甲基硅氧烷-N-丁二酰-壳聚糖生物印迹复合膜放置在容器中，在容器底部加入1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷密闭加热，使1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷均匀地沉积在薄膜表面，得到生物印迹复合膜。


2.根据权利要求1所述的一种生物印迹复合膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤一的亲水处理具体为：将载玻片在...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵超，郭媛媛，王娟，李娟，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22