一种基于嵌合P54抗原表位的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开一种基于嵌合有非洲猪瘟病毒P54蛋白抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒的非洲猪瘟病毒P54抗体检测方法及其试剂盒。本发明专利技术以嵌合核心样颗粒为包被抗原，以类似原始病毒形态更好地呈现抗原表位，同时以抗原表位特异性的单克隆抗体为阻断酶标抗体，具有更好的特异性和更优的敏感性。本发明专利技术安全性高、敏感性好、特异性强、准确度高且操作便捷，与进口试剂盒相比，检测符合率达100％。检测符合率达100％。检测符合率达100％。

【技术实现步骤摘要】
一种基于嵌合P54抗原表位的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒P54抗体检测的阻断ELISA试剂盒及其应用，适用于非洲猪瘟病毒P54抗体的特异、快速、准确检测。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染引起的烈性、高度传染性动物传染病。其急性症状以高热、网状内皮系统出血及高死亡率为特征。家猪和野猪所有品种及各年龄段均易感。钝缘蜱属软蜱，特别是O.moubata和O.erraticus，是ASFV的贮存媒介和传播媒介。此前该病仅限于非洲发生，直到上世纪中叶传到欧洲、南美及加勒比海地区，2007年传入东欧并逐渐蔓延至俄罗斯西伯利亚地区。2018年8月3日，我国确诊首例ASF疫情。随后该病在全国大范围暴发，并给我国养猪业带来巨大冲击。
[0003]ASF是全球养猪行业的“头号杀手”，强毒株引发的超急性和急性感染死亡率高达100％。由于ASFV复杂的生物学特性，目前尚未有效的商品化疫苗，因此通过血清学方法和病原学方法对ASF疫情进行监测和诊断变得至关重要。由于国内发生的ASF疫情均属急性或亚急性，感染猪只大多急性死亡，而且采取对密切接触猪群进行扑杀等防控手段，因此目前国内大多采用普通PCR和荧光PCR等分子生物学方法对ASFV进行检测，血清学方法应用较少。但随着时间的推移，ASFV不断突变，国内ASF疫情也可能发生变化，隐性感染和耐过猪只不断增多。非洲猪瘟耐过猪有这几种情况出现：血清抗体阴性或阳性，血液抗原为阴性或阳性，其中血液抗原阴性、血清抗体阳性非洲猪瘟耐过猪会间歇性排毒并导致非洲猪瘟阴性猪感染发病，说明抗原检测外，进行抗体检测非常必要。耐过猪和隐性或无症状感染猪的识别关键指标是抗体检测。疫苗尚未上市，但仍有养殖者迫切希望疫苗有突破性进展，一旦疫苗免疫后，除了最重要的生产性能指标，最直接体现免疫作用的方式是抗体检测，这就需要开展ASFV血清学检测。研究表明，ASFV P54等蛋白具有强抗原性，在感染猪只体内相应的抗体滴度较高，可作为抗原建立相应的血清学检测方法用于ASFV的抗体或抗原检测。
[0004]目前ASFV血清学检测方法主要包括间接ELISA和阻断ELISA。鉴于非洲猪瘟病毒属于高致病烈性猪传染病病毒，我国法定一类传染病病毒，按照生物安全管理要求，除农村农业部认可的实验室外，其他实验室不得操作涉及非洲猪瘟病毒分离等实验，因此商品化ELISA试剂盒都是以原核或真核表达的ASFV单个蛋白或多个蛋白包被酶标板，其敏感性和特异性在检测非洲猪瘟病毒抗体水平上有一定的局限性。
[0005]本专利技术是通过将ASFV P54蛋白抗原表位嵌合入蓝舌病病毒核心样颗粒，以近似病毒结构的形式充分展示ASFV P54蛋白抗原表位，并以该嵌合蓝舌病病毒核心样颗粒为包被抗原，以针对该ASFV P54蛋白抗原表位的单克隆抗体为阻断抗体，从而建立用于检测非洲猪瘟病毒P54抗体的阻断ELISA试剂盒，具有很好的特异性和敏感性。
[0006]有鉴于此，提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于寻求一种安全性高、敏感性好、特异性强、能够快速、简便地检测非洲猪瘟病毒P54抗体的阻断ELSIA试剂盒。
[0008]该试剂盒的优点之一是使用了以嵌合有非洲猪瘟病毒P54抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒为包被抗原，提高了检测的敏感性和特异性。
[0009]为实现上述目的，本专利技术首先提供一种嵌合P54蛋白抗原表位的重组蓝舌病病毒VP7蛋白，所述VP7蛋白的41
‑
47位柔性序列被替换为EDIQFINPYQ；
[0010]在一些优选的实施方式中，所述重组蓝舌病病毒VP7蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]进一步的，本专利技术还提供一种嵌合非洲猪瘟病毒P54蛋白抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒，所述核心样颗粒由蓝舌病病毒VP3蛋白和上述重组蓝舌病病毒VP7蛋白组装而成。
[0012]在一些优选的实施方式中，所述VP3蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]进一步的，本专利技术还提供一种非洲猪瘟病毒P54抗体检测试剂盒，所述试剂盒中包含上述的蓝舌病病毒核心样颗粒；
[0014]在一些优选的实施方式中，所述酶标板包被有上述的蓝舌病病毒核心样颗粒；
[0015]在另一些优选的实施方式中，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的针对非洲猪瘟病毒病毒P54抗原表位的单克隆抗体。
[0016]进一步的，本专利技术还提供一种非洲猪瘟病毒P54抗体检测试剂盒，为阻断ELISA试剂盒，包括酶标板和酶标阻断抗体；其中，所述酶标板的包被抗原为嵌合有非洲猪瘟病毒病毒P54抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的针对非洲猪瘟病毒病毒P54抗原表位的单克隆抗体；
[0017]在一些的实施方式中，所述P54抗原表位为EDIQFINPYQ；
[0018]在一些优选的实施方式中，该抗原表位嵌合在蓝舌病毒VP7蛋白的A41
‑
47位；
[0019]在一些更优选的实施方式中，所述嵌合后的VP7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述嵌合后的VP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示
[0020]在一些实施方式中，所述酶标板的包被方法是：将嵌合有非洲猪瘟病毒P54蛋白抗原表位的核心样颗粒用0.1
‑
0.2M pH8.0的Tris盐酸缓冲液稀释成1.0
‑
2.0μg/mL进行包被，并用含有1
‑
3％牛血清白蛋白封闭。
[0021]在一些优选的实施方式中，所述酶标板的包被方法具体是：将嵌合有非洲猪瘟病毒P54蛋白抗原表位的核心样颗粒用0.1M pH8.0的Tris盐酸缓冲液稀释成2.0μg/mL的包被工作液，然后按照100μl/孔加到96孔酶标板，4℃下放置12h，按照200μL/孔加入含有2％牛血清白蛋白的封闭液，37℃封闭处理2～3h，甩干后，待酶标板干燥后2～8℃密封保存。
[0022]在一些实施方式中，所述酶标抗体为针对非洲猪瘟病毒病毒P54蛋白抗原表位66EDIQFINPYQ75的单克隆抗体；优选的，所述酶标抗体工作浓度为1:2000
‑
1:4000；更优选的，为1:4000。
[0023]在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括0.1mg/mL的四甲基联苯胺TMD显色液和2M的硫酸溶液终止液；优选的，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照血清为经商品化试剂盒确定的非洲猪瘟阳性血清；所述阴性对照为无特定病原SPF猪血清。
[0024]进一步的，本专利技术还提供如下应用：
[0025]上述的重组蓝舌病病毒VP7蛋白，或上述的蓝舌病病毒核心样颗粒在制备用于检测非洲猪瘟病毒感染或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合P54蛋白抗原表位的重组蓝舌病病毒VP7蛋白，其特征在于，所述VP7蛋白的41
‑
47位柔性序列被替换为EDIQFINPYQ；优选的，所述重组蓝舌病病毒VP7蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种嵌合非洲猪瘟病毒P54蛋白抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒，其特征在于，所述核心样颗粒由蓝舌病病毒VP3蛋白和权利要求1所述重组蓝舌病病毒VP7蛋白组装而成。3.根据权利要求2所述的蓝舌病病毒核心样颗粒，其特征在于，所述VP3蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种非洲猪瘟病毒P54抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求2
‑
3任一所述的蓝舌病病毒核心样颗粒；优选的，所述酶标板包被权利要求2
‑
3任一所述的蓝舌病病毒核心样颗粒；更优选的，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的针对非洲猪瘟病毒病毒P54抗原表位的单克隆抗体。5.一种非洲猪瘟病毒P54抗体检测试剂盒，为阻断ELISA试剂盒，其特征在于，包括酶标板和酶标阻断抗体；其中，所述酶标板的包被抗原为嵌合有非洲猪瘟病毒病毒P54抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒；优选的，所述抗原表位嵌合在蓝舌病毒VP7蛋白的A41
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47位；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的针对非洲猪瘟病毒病毒P54抗原表位的单克隆抗体；优选的，所述P54抗原表位的单克隆抗体为P54抗原表位为EDIQFINPYQ的单克隆抗体；更优选的，所述嵌合后的VP7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。6.根据权利要求4
‑
5任一所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄超华，花群义，曹琛福，吴江，史卫军，林彦星，林永涛，翁巧玉，曾少灵，杨俊兴，
申请(专利权)人：深圳海关动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：