本发明专利技术公开了一种重组戊型肝炎口服纳米粒疫苗的制备方法和应用，所述疫苗抗原p146有良好的抗原性，在体内能够抵抗消化酶降解，在体外能够保持良好的热稳定性；所述p146的粘膜抗原递送系统是采用离子交联法制备的壳聚糖纳米颗粒(CSNPs)，该纳米粒制备方便、成本较低且无毒性，能够有效保护抗原、促进肠粘膜对抗原的摄取。本发明专利技术公开纳米粒疫苗(CSNPs/p146)粒径均一、体系稳定、有良好的生物相容性，并能够刺激小鼠产生高水平的体液、粘膜免疫应答以及Th2型细胞免疫应答，适合用于重组戊型肝炎口服疫苗领域。口服疫苗领域。口服疫苗领域。
【技术实现步骤摘要】
一种重组戊型肝炎口服疫苗及其制备方法
[0001]本专利技术涉及重组蛋白口服疫苗
，具体涉及一种将戊型肝炎重组衣壳蛋白制备成口服纳米颗粒疫苗的方法，以及该疫苗在预防戊型肝炎病毒感染中的应用。
技术介绍
[0002]戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的急性传染性疾病，在发展中国家持续构成严重威胁，每年至少有2000万 HEV感染病例，有症状的病例超过300万例，死亡人数约6万人。孕妇在妊娠晚期感染可导致高达30％的死亡率，免疫功能低下的患者感染后会慢性化。到目前为止，仍没有有效的、非致畸的针对HEV感染的特殊治疗方法，因此如何有效预防和控制HEV的传播成为一个重要的公共卫生问题。虽然现有的HE 疫苗对健康成人具有很好的保护作用，但注射类疫苗由于不良反应较多而不利于推广。相比之下，重组HE口服疫苗的研制成本较低、免疫方式简单且安全性更高，并能够刺激肠粘膜产生有中和病毒能力的分泌型IgA(sIgA)，在一定程度上可弥补注射疫苗的不足。
[0003]然而，由于直接口服蛋白类抗原产生的抗原特异性免疫反应有限，该类抗原在口服疫苗应用中仍然面临着巨大挑战。采用能够负载蛋白类抗原的纳米材料作为抗原递送系统在一定程度上可以解决上述问题。壳聚糖纳米颗粒目前已经作为一种有效的纳米载体在一系列动物模型中进行了诸多实验，并已被证明可以促进实验动物产生有效的免疫反应。迄今为止，并未有任何报道涉及壳聚糖纳米颗粒封装戊型肝炎重组衣壳蛋白在口服疫苗方面的应用前景。<br/>
技术实现思路
[0004]专利技术目的：本专利技术目的在于提供一种重组戊型肝炎口服疫苗及其制备方法，进而克服现有技术缺陷，提高戊型肝炎重组衣壳蛋白的口服生物利用度，提高口服免疫原性。
[0005]技术方案：为了解决上述问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]为了实现上述目的，本专利技术对口服戊型肝炎重组疫苗抗原p146进行体内消化酶耐受实验和热稳定性实验。
[0007]为了提高p146的生物利用度及免疫原性，本专利技术公开了一种负载重组蛋白 p146的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)将p146水溶液与三聚磷酸钠溶液按照1:1的体积比例充分混合，得到p146
‑
三聚磷酸钠混合液；
[0009](2)将p146
‑
三聚磷酸钠混合液逐滴加入壳聚糖冰醋酸溶液中，以3ml/min 的速度进行磁力搅拌，从而得到表面带正电荷的纳米颗粒。
[0010]优化地，所述p146
‑
三聚磷酸钠混合液与壳聚糖冰醋酸溶液的体积比为2:1。
[0011]优化地，所述p146
‑
三聚磷酸钠混合液中，p146浓度为0.25
‑
1mg/ml(优选 1mg/ml)，三聚磷酸钠的浓度为0.5
‑
2mg/ml(优选1mg/ml)。
[0012]优化地，所述壳聚糖冰醋酸溶液中壳聚糖浓度为0.5
‑
2mg/ml(优选2mg/ml)
[0013]优化地，所述纳米颗粒制备体系的pH值为5.5
‑
7.0(优选6.0)。
[0014]优选地，所述壳聚糖壳聚糖脱乙酰度≧95％，粘度为100
‑
200mpa.s，所述负载p146的壳聚糖纳米颗粒的粒径为376.0
±
109.4nm，PDI为0.397
±
0.02，zeta电位为18.0
±
1.2mv，包封率为65.0
±
5.0％，载药量为67.5
±
7.5％。
[0015]技术效果：
[0016](1)p146在体内不被消化酶降解，保证了其经过消化道后的完整性；
[0017](2)p146在体外具有较好热稳定性，降低了运输和保存成本。
[0018](3)采用生物可降解的壳聚糖纳米颗粒负载p146，制成的口服疫苗具有良好的生物相容性，在免疫过程中能够保证安全性；
[0019](4)壳聚糖可以可逆瞬时地打开小肠上皮细胞间的紧密连接，故用壳聚糖纳米颗粒装载p146进行口服免疫，能够提高p146的吸收效率和生物利用度，进而提高其免疫原性。
附图说明
[0020]图1：检测p146灌胃后小鼠粪中的剩余蛋白。其中a图为SDS
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PAGE，b图为Western
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blot。1为纯化p146(灌胃前)，2为灌胃小鼠的粪悬液，3为空白粪悬液对照。
[0021]图2：间接ELISA检测p146的抗原性。横坐标为HEV中和性单抗1G10的稀释度，纵坐标为双波长450nm/630nm时测定各孔OD值。
[0022]图3：p146的热稳定性研究。图a和b分别为2w和4w时p146在不同温度环境下的降解程度。
[0023]图4：TEM下观察负载p146的壳聚糖纳米颗粒。图(1)(2)标尺均为100nm； (3)(4)为平均直径计算，采用Image
‑
Pro Plus软件。
[0024]图5：FE
‑
SEM观察负载p146的壳聚糖纳米颗粒形貌。图(a)标尺为1μm，图 (b)(c)为300nm，图(d)为100nm。
[0025]图6：DLS检测纳米颗粒的平均粒径。其中横坐标代表粒径范围。
[0026]图7：纳米颗粒的表征。图a(1)为包封率和载药量，a(2)为体外蛋白释放率；图b为MTT法细胞毒性检测。
[0027]图8：TEM检测酸处理前后CSNPs的结构。(a)为酸处理前，(b)为酸处理后。
[0028]图:9：口服免疫小鼠后血清抗体IgG滴度检测。(a)为空白对照，(b)为不载p146 的壳聚糖纳米颗粒，(c)纯化p146，(d)为载p146的壳聚糖纳米颗粒。血清从1:10 0开始做倍比稀释，共八个稀释度。
[0029]图10：不同免疫组小鼠的血清IgG和粪悬液sIgA的几何平均滴度(GMT)。统计学分析采用two
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way
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Anova，作图软件为GraphPad。*P<0.05，**P<0.01， ns P>0.05。
[0030]图11：口服免疫小鼠后粪悬液sIgA OD值检测。(a)为空白对照，(b)为不载 p146的壳聚糖纳米颗粒，(c)纯化p146，(d)为载p146的壳聚糖纳米颗粒。粪悬液从1:10开始做倍比稀释，共八个稀释度。
[0031]图12：初次免疫后11W不同免疫组小鼠肠粘膜灌洗液sIgA OD值比较。(a) 灌洗液从1:10开始做倍比稀释，共八个稀释度；(b)肠粘膜灌洗液稀释度为1:10 时sIgA OD值的统计学分析。统计学分析采用one
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way
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Anova本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种重组戊型肝炎口服疫苗，其特征在于，所述疫苗抗原p146由壳聚糖纳米颗粒封装递送。2.根据权利要求1所述的重组戊型肝炎口服疫苗，其特征在于，所述疫苗抗原p146能够抵抗消化道环境。3.根据权利要求1所述的重组戊型肝炎口服疫苗，其特征在于，所述疫苗由壳聚糖和三聚磷酸钠通过离子交联法封装p146获得，壳聚糖脱乙酰度≧95％，粘度为100
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200mpa.s。4.根据权利要求1所述的重组戊型肝炎口服疫苗，其特征在于，该疫苗为纳米颗粒，粒径为376.0
±
109.4nm，采用口服方式进行免疫。5.一种重组戊型肝炎口服疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将壳聚糖溶解于0.5％的冰醋酸水溶液，将三...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟继鸿，魏文娟，
申请(专利权)人：滁州市方舟医疗科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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