一种母乳外泌体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种母乳外泌体及其制备方法与应用，具体为母乳外泌体在制备肠道上皮屏障蛋白保护剂或者损伤修复剂中的应用。现有技术公开了母乳外泌体促进肠道细胞迁移与增殖，对抗肠道损伤，但是没有给出母乳外泌体对肠道上皮屏障蛋白的作用启示。本发明专利技术创造性的提出母乳外泌体在制备肠道上皮屏障蛋白保护剂中的应用，为母乳外泌体的新应用，扩展了母乳外泌体的应用范围。泌体的应用范围。泌体的应用范围。

【技术实现步骤摘要】
一种母乳外泌体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于新生儿科
，具体涉及母乳外泌体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）为一种获得性疾病，是多种原因引起的肠黏膜损害，使之缺血、缺氧，导致小肠、结肠发生弥漫性或局部坏死的一种疾病。尽管新生儿医疗和全球新生儿重症监护室（NICUs）的建立，新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）仍是一种毁灭性疾病，特别是早产儿。外泌体是从细胞中释放的微小（100
‑
200 nm）小泡，携带蛋白质、微RNA（miRNA）和信使RNA（mRNA），可以信号和调控细胞间行为，作为粒径纳米级的天然囊泡具有介导细胞间信号转导、抗原呈递和兔疫应答等功能。母乳中富含外泌体，可促进细胞增殖和迁移，减轻炎症，对新生儿相关疾病具有保护潜能，现有技术分析母乳性黄疸患儿肠道菌群特征,筛选与差异细菌有相互作用位点的母乳外泌体miRNA,说明miRNA可能通过调节乳儿肠道菌群影响新生儿母乳性黄疸的发生发展。利用16S rRNA高通量测序分析两组粪便样本肠道菌群特征,筛选出可能与新生儿胆红素代谢相关的差异性特殊菌种,然后用透射电镜和Western blotting两种方法鉴定从母乳中提取的外泌体囊泡,并通过miRBase数据库预测与特异性细菌基因组有相互作用位点的miRNA,利用荧光定量PCR验证预测的miRNA在母乳外泌体中表达的差异,探究母乳中差异表达的miRNA与肠道菌群的相关性。但是未见母乳外泌体对肠道上皮屏障蛋白的影响报道。

技术实现思路

[0003]本专利技术公开了母乳外泌体的新应用，公开了母乳外泌体对肠道上皮屏障蛋白的保护。现有技术探究母乳外泌体miRNA与肠道菌群的相关性，通过miRBase数据库预测与E.coli基因组有相互作用位点的miRNA，筛选出组间存在差异表达的分子，经预测，hsa
‑
miR
‑
16
‑
5p与大肠杆菌ATP结合蛋白基因具有相互作用位点。采取预扩增法定量miRNA，结果发现miR
‑
16
‑
5p在两组间表达具有显著差异。但是该研究与母乳外泌体对肠道上皮屏障蛋白的作用无关。
[0004]本专利技术采用如下技术方案：母乳外泌体在制备肠道上皮屏障蛋白保护剂中的应用。
[0005]母乳外泌体在制备结肠炎治疗剂中的应用。
[0006]本专利技术中，母乳为人母乳。母乳外泌体的制备方法为，将母乳离心处理后，取乳清用母乳外泌体提取试剂盒提取，得到母乳外泌体。优选的，离心处理、试剂盒提取都在室温下进行，离心处理为2000
×
g离心10分钟。
[0007]本专利技术中，保护剂为药物、食物、营养品或者保健品，以母乳外泌体为活性成分即可；治疗剂为药物、食物、营养品或者保健品，以母乳外泌体为活性成分即可。
[0008]本专利技术中，肠道上皮屏障蛋白为肠上皮细胞紧密连接蛋白，具体为咬合蛋白（Occludin）、闭合蛋白（Claudin1）及闭合小环蛋白（ZO
‑
1，一种胞浆蛋白）。
[0009]本专利技术中，结肠炎为新生儿坏死性小肠结肠炎。
[0010]目前母乳缓解或者治疗新生儿坏死性小肠结肠炎的机理不明，现有技术公开了母乳外泌体促进肠道细胞迁移与增殖，对抗肠道损伤，但是没有给出母乳外泌体对肠道上皮屏障蛋白的作用启示。本专利技术创造性的提出母乳外泌体在制备肠道上皮屏障蛋白保护剂中的应用，为母乳外泌体的新应用，扩展了母乳外泌体的应用范围。
附图说明
[0011]图1为母乳外泌体的TEM图；图2为母乳外泌体的粒径分布；图3为母乳外泌体的蛋白表达电泳图；图4为母乳外泌体的蛋白含量；图5为mRNA的表达（Caco
‑
2）；图6为mRNA的表达（NCM460）；图7为肠道上皮屏障蛋白电泳图（Caco
‑
2）；图8为肠道上皮屏障蛋白电泳图（NCM460）；图9为不同制备方法得到的母乳外泌体mRNA的表达（Caco
‑
2）；图10为动物实验结果。
具体实施方式
[0012]在签署知情同意书后，招募健康的哺乳期母亲，她们在分娩后在苏州儿童医院住院，33名母亲分娩了足月儿（≥37周）、21名母亲分娩了早产儿（24
‑
36周）。所有的母亲都生产过多的母乳，这些母乳通常被丢弃，这些多余的母乳样本是为研究目的而收集的。泌乳时间，在婴儿出生后的第3天采集初乳样本。对于出院的婴儿，在新生儿随访门诊采集其母亲的母乳，时间为出生后3
‑
10天。母乳采集得到了母亲和苏州儿童医院伦理委员会的批准。
[0013]ZO
‑
1、claudin 1和occludin的mRNA表达水平通过两步RT
‑
qPCR进行检测。用TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific, Inc., US)从细胞中提取mRNA。用qScript cDNA SuperMix（Quantabio，US）和S1000热循环器（Bio
‑
Rad Laboratories, Inc., US）制备互补DNA（cDNA）。RT
‑
qPCR采用Advanced qPCR Master Mix与CFX384实时系统(Bio
‑
Rad Laboratories, Inc.)进行，以甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶（GAPDH）做内参；引物如下：ZO
‑
1: 正向引物, 5
ʹ
‑
TGCCATTACACGGTCCTCTG
‑3ʹ
；反向引物, 5
ʹ
‑
GGTTCTGCCTCATCATTTCCTC
‑3ʹ
Claudin 1: 正向引物, 5
ʹ
‑
GAGCGAGTCATGGCCAAC
‑3ʹ
；反向引物, 5
ʹ
‑
TCTCAATGTCCATTTTCGGTTT
‑3ʹ
Occludin: 正向引物, 5
ʹ
‑
AGTGTGATAATAGTGAGTGCTATCC
‑3ʹ
；反向引物5
ʹ
‑
TGTCATACCTGTCCATCTTTCTTC
‑3ʹ
。
[0014]蛋白质印迹（Western blot.）。细胞接种在6孔板上，密度为3.5
×
105，用RIPA缓冲液（150mM NaCl，1.0%Triton X
‑
100，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠，1mM苯甲基磺酰氟和50mM Tris；pH 8.0）溶解。总蛋白浓度用常规BCA法测定，调整至1μg/μl；添加5倍加样缓冲液并在100℃下煮沸10分钟，之后将每个样品的蛋白质体积本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种母乳外泌体，其特征在于，将母乳离心处理后，取乳清用母乳外泌体提取试剂盒提取，得到母乳外泌体。2.根据权利要求1所述母乳外泌体，其特征在于，离心处理为2000
×
g离心10分钟。3.根据权利要求3所述母乳外泌体，其特征在于，离心处理、试剂盒提取都在室温下进行。4.权利要求1所述母乳外泌体在制备肠道上皮屏障蛋白保护剂或者损伤修复剂中的应用。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，母乳为人母乳。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱雪萍，朱晓黎，何山，胡筱涵，耿海峰，李文梅，吴志新，孙文强，许云云，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：