核酸提取用乳化剂、含有该乳化剂的裂解结合液和核酸提取试剂盒及其应用制造技术

本申请公开了一种核酸提取用乳化剂、含有该乳化剂的裂解结合液和核酸提取试剂盒及其应用。该乳化剂包括吐温

【技术实现步骤摘要】
核酸提取用乳化剂、含有该乳化剂的裂解结合液和核酸提取试剂盒及其应用


[0001]本申请涉及生物医学领域，具体涉及核酸提取用乳化剂、含有该乳化剂的裂解结合液和核酸提取试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]1948年，科学家首次发现在人类的血液循环中存在着循环核酸(cfDNA,circulating free DNA)，即游离于细胞外的DNA。cfDNA主要由部分降解的机体内源性DNA组成，是高度碎片化的DNA片段的混合体。在健康人的血浆中，cfDNA来自于凋亡细胞，而癌症病人血浆中的cfDNA除来自于凋亡细胞外，还来自于肿瘤细胞主动释放出的DNA及肿瘤细胞坏死溶解释放出的DNA。人体胚胎的cfDNA能够通过胎盘组织脱落的凋亡细胞进入母体的血液循环，因此在孕妇的外周血中也存在着一定比例的胎儿游离DNA(cell free fetal DNA，cffDNA)。目前，cfDNA在胎儿无创产前诊断、肿瘤的早期诊断与预后、感染性疾病检测和治疗领域具有广泛的应用前景。基于胎儿游离DNA和肿瘤游离DNA(cell free tumor DNA，ctDNA)的无创产前筛查和肿瘤液体活检技术在临床中应用日益广泛，且发展极其迅速。
[0003]cfDNA具有含量少、半衰期短的特点，使其在提取过程中容易丢失，提取难度大，且血液中含有的一些成分如油脂、蛋白质等会进一步降低提取效率。目前提取cfDNA最常用的方法主要有传统的酚
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氯仿
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异戊醇法，硅胶膜吸附柱法，酚
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氯仿
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异戊醇法提取效率较低且要用到有毒的有机试剂，硅胶膜吸附柱法需要反复离心，极大地降低了检测通量，且硅胶柱法回收率较低，不太适合用于小片段的提取。

技术实现思路

[0004]为了改善上述问题，本申请提供了一种核酸提取用乳化剂、含有该乳化剂的裂解结合液和核酸提取试剂盒及其应用，该核酸提取用乳化剂可以有效地溶解血浆中的油脂，降低其对cfDNA提取的影响。本申请提供一种核酸提取用乳化剂，包括吐温
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20、TritonX
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100和十二烷基二甲基甜菜碱，所述吐温
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20、TritonX
‑
100和十二烷基二甲基甜菜碱的体积比为(1
‑
15):(0.2
‑
5):1。
[0005]本申请还提供一种核酸提取用裂解结合液，包括离液盐、第一蛋白质变性剂、螯合剂、缓冲剂、乳化剂和醇类，所述乳化剂包括吐温
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20、TritonX
‑
100与十二烷基二甲基甜菜碱。
[0006]根据本申请，所述乳化剂中吐温
‑
20、TritonX
‑
100和十二烷基二甲基甜菜碱的体积比为(1
‑
15):(0.2
‑
5):1
[0007]根据本申请，以所述裂解结合液的总体积计，所述乳化剂的体积百分比为7％
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25％。
[0008]根据本申请，以所述裂解结合液的总体积计，吐温
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20的体积百分比为5％
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15％，
TritonX
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100的体积百分比为1％
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5％，十二烷基二甲基甜菜碱的体积百分比为1％
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5％。
[0009]根据本申请，所述离液盐为碘化钠、氯化锂和高氯酸钠中的一种或多种；所述第一蛋白质变性剂为SDS、盐酸胍和异硫氰酸胍的一种或多种；所述螯合剂为EDTA或其钠盐，或柠檬酸钠；所述缓冲剂为Tris
‑
HCl；所述醇类为异丙醇或无水乙醇。
[0010]根据本申请，以所述裂解结合液的总体积计，所述离液盐的摩尔浓度为3mol/L
‑
6mol/L；所述第一蛋白质变性剂中SDS的浓度为30
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70mmol/L，盐酸胍和/或异硫氰酸胍的浓度为2mol/L
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6mol/L；所述螯合剂的摩尔浓度为5
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20mmol/L；所述缓冲剂的摩尔浓度为20
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100mmol/L；所述醇类的体积分数为20％
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50％。
[0011]本申请还提供一种核酸提取试剂盒，包括蛋白酶K、磁珠悬液、洗涤液、漂洗液、洗脱液以及如上所述的核酸提取用裂解结合液。
[0012]根据本申请，所述蛋白酶K的工作浓度为15
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50mg/mL。
[0013]根据本申请，所述洗涤液包括无水乙醇与蛋白质变性剂的组合，所述第二蛋白质变性剂可为盐酸胍或异硫氰酸胍的一种或两种，以所述洗涤液的总体积计，所述洗涤液中无水乙醇的体积分数为20％
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50％，所述第二蛋白质变性剂浓度为2mol/L
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6mol/L。
[0014]本申请还提供上述的核酸提取试剂盒在cfDNA提取中的应用。
[0015]相应的，本申请还提供一种核酸提取方法，包括将样本与所述蛋白酶K、裂解结合液和磁珠悬液混合后室温条件下裂解15
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60min；静置于磁力架上1
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10min；加入洗涤液，放置在磁力架上，待磁珠完全聚集后，分离去除上清液；加入漂洗液，放置在磁力架上，待磁珠完全聚集后，分离去除上清液；加入洗脱液，混匀，37
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60℃恒温孵育5
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15min，置于磁力架上，待磁珠完全聚合后，吸出上清液留存。
[0016]有益效果：本申请提供的裂解结合液采用特定的乳化液组成，实现优异的裂解效果，可与磁珠纯化法有效结合，显著降低DNA损失；进而本申请提供的核酸提取试剂盒与方法能够对各种类型的血浆样品具有优异的DNA提取效率，尤其是针对油脂较高的样品具有显著优异的提取效率。
附图说明
[0017]图1为实施例中ACTB基因Ct值和拷贝数标准曲线。
具体实施方式
[0018]下面将结合具体实施例对本申请的技术方案作更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性的说明和解释本申请，而不应被解释为对本申请保护范围的限制。凡基于本申请上述内容所实现的技术均涵盖在本申请旨在保护的范围内。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或制造厂商所建议的条件。
[0019]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
[0020]在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。用语第一、第二、第三等仅
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸提取用乳化剂，其特征在于，包括吐温
‑
20、TritonX
‑
100和十二烷基二甲基甜菜碱，所述吐温
‑
20、TritonX
‑
100和十二烷基二甲基甜菜碱的体积比为(1
‑
15)：(0.2
‑
5):1。2.一种核酸提取用裂解结合液，其特征在于，包括离液盐、第一蛋白质变性剂、螯合剂、缓冲剂、乳化剂与醇类，所述乳化剂包括吐温
‑
20、TritonX
‑
100与十二烷基二甲基甜菜碱。3.根据权利要求2所述的核酸提取用裂解结合液，其特征在于，所述乳化剂中吐温
‑
20、TritonX
‑
100和十二烷基二甲基甜菜碱的体积比为(1
‑
15)：(0.2
‑
5):1。4.根据权利要求2所述的核酸提取用裂解结合液，其特征在于，以所述裂解结合液的总体积计，所述乳化剂的体积百分比为7％
‑
25％。5.根据权利要求3或4所述的核酸提取用裂解结合液，其特征在于，以所述裂解结合液的总体积计，吐温
‑
20的体积百分比为5％
‑
15％，TritonX
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100的体积百分比为1％
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5％，十二烷基二甲基甜菜碱的体积百分比为1％
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5％。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：张良禄，郭洪，董兰兰，蔡迪，胡月，李婷婷，
申请(专利权)人：武汉艾米森生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：