用于纯化信使RNA的方法技术

本发明专利技术尤其提供了基于常规流过滤来纯化mRNA以用于治疗用途的方法。mRNA以用于治疗用途的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纯化信使RNA的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2018年8月24日提交的美国序列号62/722,674的权益和优先权，将所述专利的内容整体并入本文。

技术介绍

[0003]信使RNA(mRNA)治疗剂是有前途的新治疗剂；例如，mRNA疗法可以是传统的蛋白质替代疗法、抗体疗法、疫苗疗法和/或基因疗法的替代方案。在mRNA治疗剂中，将编码特定酶、抗体、抗原或其他蛋白质或肽的完整mRNA递送至靶细胞，并通过细胞自身的天然翻译机制翻译成完整的酶、抗体、抗原或其他蛋白质或肽。通常使用体外转录系统用酶诸如从模板质粒DNA转录mRNA的RNA聚合酶，随同或随后添加5'
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帽和3'
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聚腺苷酸化，合成用于此类治疗剂的mRNA。此类反应产生组合物，所述组合物同时包含全长mRNA和各种不希望的污染物(例如所述反应中使用的蛋白质、盐、缓冲液和非RNA核酸)，所述污染物必须除去以提供可用于mRNA替代治疗剂的纯净且均质的mRNA。
[0004]传统上，小规模的mRNA是通过可商购的基于硅胶的柱系统(诸如Qiagen试剂盒)，或者通过蛋白质萃取到有机混合物(苯酚:氯仿:异戊醇)中并且随后进行乙醇沉淀从体外转录反应中纯化而来。这些方法的规模有限，因为它们最多可以提供5至10mg的纯净且均质的mRNA；因此，它们不足以满足mRNA的临床和商业治疗用途的需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种部分基于使用常规流过滤(normal flow filtration)可以有效地将体外合成的mRNA纯化至适合于临床或商业治疗用途的纯度的惊人发现的用于大规模纯化体外合成的mRNA的改进方法。重要的是，本文所述的常规流过滤方法导致出乎意料高的产率的具有高纯度和完整性的mRNA。因此，本专利技术允许更有效和成本有效地制造用于治疗用途的高质量mRNA。
[0006]如本文所用，术语“常规流过滤”是指其中待纯化的材料沿相对于过滤器表面常规(即垂直)的方向流动的过滤过程。太大而无法通过过滤器的材料得以保留，然而较小的材料通过成为滤液。
[0007]在一个方面，本专利技术提供了一种纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括以下步骤：(a)沉淀在包含来自制造所述mRNA的一种或多种污染物的组合物中的mRNA，以提供包含沉淀的mRNA的悬浮液；(b)使包含沉淀的mRNA的悬浮液经过过滤器，其中所述沉淀的mRNA被过滤器保留；(c)通过洗涤来自步骤(b)的包含保留的沉淀mRNA的过滤器来洗涤沉淀的mRNA；(d)溶解在步骤(c)中被过滤器保留的沉淀mRNA，从而使纯化的mRNA通过过滤器；以及(e)从步骤(d)中回收纯化的mRNA，其中步骤(b)、(c)和(d)中的每一个步骤均使用常规流过滤进行。
[0008]在一些实施方案中，制造mRNA包括体外转录(IVT)合成。在一些实施方案中，制造mRNA包括在合成后对所述mRNA进行5'
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加帽的步骤。在一些实施方案中，制造mRNA不包括对
所述mRNA进行5'
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加帽的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(e)之后用5'帽对纯化的mRNA进行加帽的步骤。
[0009]在一些实施方案中，制造mRNA包括对mRNA进行3'
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加尾的步骤。在一些实施方案中，制造mRNA不包括对mRNA进行3'
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加尾的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(e)之后对纯化的mRNA进行3'加尾的步骤。
[0010]在一些实施方案中，制造mRNA不包括对mRNA进行5'
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加帽的步骤，并且不包括对mRNA进行3'
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加尾的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(e)之后用5'帽对纯化的mRNA进行加帽和对纯化的mRNA进行3'加尾的步骤。
[0011]在一些实施方案中，所述一种或多种污染物包含酶。在一些实施方案中，所述酶是用于IVT合成mRNA的聚合酶。在一些实施方案中，所述酶是加帽酶。在一些实施方案中，所述酶是聚A聚合酶。在一些实施方案中，所述一种或多种污染物包含盐。在一些实施方案中，所述一种或多种污染物包含短的异常终止的转录物。
[0012]在一些实施方案中，适合用于常规流过滤的过滤器具有实质上小于沉淀的mRNA且大于可溶性mRNA或污染物的孔径(例如孔直径)或分子量截止(MWCO)，使得当可溶性污染物流过时沉淀的mRNA可以保留在过滤器上。
[0013]在一些实施方案中，适合用于本专利技术的过滤器是膜过滤器。在一些实施方案中，膜过滤器具有实质上小于沉淀的mRNA且大于可溶性mRNA或污染物的分子量截止(MWCO)。
[0014]在一些实施方案中，膜过滤器具有褶状过滤器、缠绕状过滤器或胶囊状过滤器的形式。在一些实施方案中，过滤器包含滤网。
[0015]在一些实施方案中，适合用于本专利技术的过滤器是深层过滤器。在一些实施方案中，所述深层过滤器具有实质上小于沉淀的mRNA且大于可溶性mRNA或污染物的孔径或孔直径。
[0016]在一些实施方案中，过滤器由惰性材料制成。在一些实施方案中，适合用于本专利技术的惰性材料是聚丙烯。在一些实施方案中，惰性材料是改性的聚醚砜(mPES)。在一些实施方案中，惰性材料是聚醚砜(PES)。在一些实施方案中，惰性材料是聚偏二氟乙烯(PVDF)。在一些实施方案中，惰性材料是纤维素。在一些实施方案中，惰性材料是硅藻土。在一些实施方案中，惰性材料是聚四氟乙烯(PTFE)。在一些实施方案中，惰性材料是硝化纤维素。在一些实施方案中，惰性材料是聚乙烯。在一些实施方案中，惰性材料是聚丙烯腈。在一些实施方案中，惰性材料是聚碳酸酯。在一些实施方案中，惰性材料是尼龙。
[0017]在一些实施方案中，过滤器包含一种或多种三维基质。在一些实施方案中，所述一种或多种三维基质是毡基质。在一些实施方案中，所述毡的厚度为约1毫米(mm)至约1厘米(cm)(例如，约1
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500mm、约1
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400mm、约1
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300mm、约1
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200mm、约1
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100mm、约1
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50mm、约1
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40mm、约1
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30mm、约1
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20mm、约1
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10mm、或约1
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5mm)。在一些实施方案中，所述毡的厚度在1
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10mm之间。在一些实施方案中，所述毡的厚度在1
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5mm之间。在一些实施方案中，所述毡的厚度为小于1厘米、小于0.5cm、小于0.4cm、小于0.3cm、小于0.25cm、小于0.2cm、小于0.1cm、小于50mm、小于40mm、小于30mm、小于25mm、小于20mm、小于15mm、小于10mm或小于5mm。在一些实施方案中，过滤器包含至少两种、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括以下步骤：(a)从包含来自制造所述mRNA的一种或多种污染物的溶液中沉淀mRNA，以提供包含沉淀的mRNA的悬浮液；(b)使包含所述沉淀的mRNA的所述悬浮液经过过滤器，其中所述沉淀的mRNA被所述过滤器保留；(c)溶解步骤(b)中被所述过滤器保留的所述沉淀的mRNA，从而允许纯化的mRNA通过所述过滤器；以及(d)从步骤(c)中回收所述纯化的mRNA；其中步骤(b)和(c)中的每一个步骤均使用常规流过滤进行。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述制造包括所述mRNA的体外转录(IVT)合成。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述制造包括所述mRNA的5
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加帽的步骤。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制造包括所述mRNA的3'
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加尾的步骤。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种污染物包含酶。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述酶是聚合酶。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述酶是加帽酶。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种污染物包含盐。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种污染物包含短的异常终止的转录物。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括洗涤来自步骤(b)的保留在所述过滤器上的所述沉淀的mRNA的步骤。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器是膜过滤器或深层过滤器。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述过滤器是深层过滤器。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器具有褶状过滤器、缠绕状过滤器或胶囊状过滤器的形式。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器包含滤网。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器由惰性材料制成。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述惰性材料是聚丙烯。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述惰性材料是改性的聚醚砜(mPES)。18.根据权利要求15所述的方法，其中所述惰性材料是聚醚砜(PES)。19.根据权利要求15所述的方法，其中所述惰性材料是聚偏二氟乙烯(PVDF)。20.根据权利要求15所述的方法，其中所述惰性材料是纤维素。21.根据权利要求15所述的方法，其中所述惰性材料是硅藻土。22.根据权利要求15所述的方法，其中所述惰性材料是聚四氟乙烯(PTFE)。23.根据权利要求15所述的方法，其中所述惰性材料是硝化纤维素。24.根据权利要求15所述的方法，其中所述惰性材料是聚乙烯。25.根据权利要求15所述的方法，其中所述惰性材料是聚丙烯腈。26.根据权利要求15所述的方法，其中所述惰性材料是聚碳酸酯。
27.根据权利要求15所述的方法，其中所述惰性材料是尼龙。28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器包含一种或多种三维基质。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述一种或多种三维基质是毡基质。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述毡的厚度在1
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10mm的范围内。31.根据权利要求29所述的方法，其中所述毡的厚度在1
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5mm的范围内。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器包含至少两种三维基质。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器包含堆叠的三维基质。34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器具有促进保留所述沉淀的mRNA同时允许溶解的污染物通过的平均孔径。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述平均孔径在0.001μm与500μm之间、在0.01μm与200μm之间、或在0.05μm与100μm之间。36.根据权利要求34所述的方法，其中所述平均孔径为0.05μm或更大。37.根据权利要求34所述的方法，其中所述平均孔径为0.5μm或更大。38.根据权利要求34所述的方法，其中所述平均孔径为5μm或更大。39.根据权利要求34所述的方法，其中所述平均孔径为10μm或更大。40.根据权利要求34所述的方法，其中所述平均孔径为20μm或更大。41.根据权利要求28所述的方法，其中所述平均孔径为25μm或更大。42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器具有不为分布在所述过滤器上的mRNA的量提供凝胶层的总表面积。43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法不需要向所述悬浮液中添加分散剂。44.根据权利要求10
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43中任一项所述的方法，其中洗涤所述沉淀的mRNA的步骤包括用一次或多次盐洗涤来洗涤所述沉淀的mRNA。45.根据权利要求10
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44中任一项所述的方法，其中洗涤所述沉淀的mRNA的步骤包括使用有机溶剂进行的一次或多次洗涤。46.根据权利要求45所述的方法，其中洗涤所述沉淀的mRNA的步骤包括一次或多次包含乙醇的洗涤。47.根据权利要求10
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44中任一项所述的方法，其中洗涤所述沉淀的mRNA的步骤不包括包含有机溶剂的洗涤。48.根据权利要求10
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47中任一项所述的方法，其中洗涤所述沉淀的mRNA的步骤包括一次或多次包含聚乙二醇(PEG)的洗涤。49.根据权利要求48所述的方法，其中所述一次或多次包含聚乙二醇(PEG)的洗涤各自具有50厘沲或更小的粘度。50.根据权利要求10
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49中任一项所述的方法，其中洗涤所述沉淀的mRNA的步骤包括一次或多次包含三乙二醇(TEG)的洗涤。51.根据权利要求10
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49中任一项所述的方法，其中洗涤所述沉淀的mRNA的步骤包括一次或多次包含三乙二醇单甲醚(MTEG)的洗涤。52.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述常规流过滤包括以下中的一项
或多项：恒定流；恒定压力；可变流；可变压力；通过芯吸的流；以及重力控制。53.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述常规流过滤包含一次使用的系统和/或过滤器。54.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述常规流过滤包含多次使用的系统和/或过滤器。55.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述回...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：川斯勒佰尔公司，
类型：发明
国别省市：