一种适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法技术

本发明专利技术公开了一种适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法，包括如下步骤：(1)菌体培养与收集；(2)反复洗涤菌体；(3)溶菌酶处理芽孢杆箘细胞壁；(4)液氮速冻；(5)加入RNAiso Plus震荡后放入水浴锅中加热；(6)氯仿提纯两次，并采用异丙醇沉淀；(7)采用DEPC乙醇清洗沉淀后再用无水乙醇清洗。(8)采用核酸密度检测仪和琼脂糖凝胶检测所提RNA的浓度和质量。本发明专利技术有效的方法解决了常规提取方法提取芽孢杆箘存在的RNAA260/A280以及A260/A230比值偏低及无机盐污染的情况。同时很大程度上去除了rRNA和tRNA，完整的保留了mRNA，更有利于后续实验的进行。的进行。的进行。

【技术实现步骤摘要】
一种适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法。

技术介绍

[0002]细菌RNA的提取相对于真核生物来说，难度更大。芽孢杆箘属于革兰氏阳性菌，相对于革兰氏阴性菌，其细胞壁厚(约20
‑
80nm,革兰氏阴性菌约8
‑
20nm)层数多(约15
‑
50层，革兰氏阴性菌约1
‑
3层)，细胞壁中的肽聚糖含量高(占细胞干重的50％
‑
80％，革兰氏阴性菌为10％
‑
20％)，且交联更为致密(1)。相对于RNA提取，有效的细胞裂解是获得高质量及高产量RNA必要且至关重要的前提条件。目前，常用的细菌细胞壁破碎法有超声波法、酶解法、液氮研磨法等等(2，3)，但这些常规的这些方法很难有效的破碎芽孢杆箘的细胞壁。除此之外，细胞壁破碎后，芽孢杆箘的内含物很容易与RNA结合，形成多糖多和酚类难溶的物质，导致RNA分离困难(4，5)。
[0003]芽孢杆菌属内多数种都具有强大的蛋白质外泌系统，能向胞外分泌多种酶，分泌的酶量大、种类多，其中就包括了RNA酶，而其产生的内源性RNA酶也加大了RNA提取的难度(6)。相对真核细胞来说，细菌RNA的半衰期较短，5
′
没有帽子结构，3
′
没Poly(A)尾巴，本身就很容易降解(7)，也加大了芽孢杆箘RNA提取的难度，因此常规的试剂盒无法提取高质量的芽孢杆箘RNA。
[0004]一般从材料中提取出的RNA中，rRNA大约占80％，tRNA约占10％～15％，mRNA约占1％～5％。而对于许多后续的分子生物学实验，rRNA和tRNA通常是没有用处的(8)。因此，研究人员常采用一些方法如加热法来去除总RNA中的rRNA和tRNA，以便更加有效地用于后续实验(1)。
[0005]芽孢杆菌属内多数种都能向胞外分泌多种酶，尤其是胞外分泌的RNA酶很容易造成RNA降解。因此，针对该问题，采用2mL的0.1％DEPC灭菌水对收集的菌体进行反复清洗(不少于4次)，以去除芽孢杆箘分泌的胞外酶，降低后续提取过程中RNA的降解。
[0006]由于芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，其细胞壁厚而致密，因此常规的提取方法不能有效裂解细胞壁使内容物释放，从而导致所提取的RNA出现浓度偏低的情况。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，而提供了一种适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法。
[0008]为了解决现有技术的问题，本专利技术提供了如下技术方案：本专利技术的一种适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法，包括如下步骤：
[0009](1)菌体培养与收集；
[0010](2)反复洗涤菌体；
[0011](3)溶菌酶处理芽孢杆箘细胞壁；
[0012](4)液氮速冻；
[0013](5)加入RNAiso Plus震荡15min后放入100℃水浴锅中加热15
‑
25min；
[0014](6)氯仿提纯两次，并用异丙醇沉淀；
[0015](7)采用75％的DEPC乙醇清洗沉淀2次后再用无水乙醇清洗2次。
[0016](8)采用核酸密度检测仪和1％的琼脂糖凝胶检测所提RNA的浓度和质量。
[0017]进一步地，在步骤(1)中，菌体培养与收集：液体培养：37℃，16h，至OD至1.0，超过1.3抽提效果不好，取2
‑
4ml菌液，于2ml RNA
‑
free离心管中12000rpm
‑1离心1min，去除上清，收集菌体；平板培养：30℃，7天至对照TR4长至满板，约5
‑
7D，用枪头挑取芽孢杆箘与TR4相邻的菌落边缘，至装有0.1％DEPC灭菌水的2ml RNA
‑
free离心管中，中12000rpm
‑1离心1min，去除上清，收集菌体相同生长时期单独培养的芽孢杆箘作为对照。本专利技术采用的提取液是RNAiso Plus(TAKARA,Code No.9109)，用于提取芽孢杆箘种的总RNA。
[0018]进一步地，在步骤(2)中，反复洗涤菌体：向所收集的菌体加入2ml 0.1％DEPC水，12000rpm
‑1离心1min，去除上清，收集菌体；将步骤(2)重复4次。本专利技术采用的灭菌水必须是经过0.1％的DEPC(焦碳酸二乙酯)在120℃高温高压条件下处理30分钟的。
[0019]进一步地，在步骤(3)中，溶菌酶处理芽孢杆箘细胞壁：向上述菌体加入1ml 0.1％DEPC水，重悬菌体，再加入40ul溶菌酶，至终浓度为4mg/ml，37℃摇床120rpm 3
‑
4h，12000rpm
‑1离心1min，收集菌体。本专利技术中溶菌酶母液配置：取0.4g溶菌酶溶解于4ml 0.1％DEPC水至终浓度为100mg/ml，4℃保存。
[0020]进一步地，在步骤(4)中，将收集的菌体迅速置于液氮中，冷冻3min。
[0021]进一步地，在步骤(5)中，加入1
‑
1.5ml RNAiso Plus，震荡15min，放入100℃水浴锅中加热15
‑
25min，迅速冰浴；
[0022]进一步地，在步骤(6)中，加入1/5体积的氯仿；震荡5min，室温静置5min；取上清至新的RNA
‑
free离心管中，再次加入氯仿，重复该步骤2次。(注：在步骤(6)中，加入1/5体积的氯仿指如加入1ml RNAiso Plus则加入氯仿200ul，如加入1ml RNAiso Plus则加入氯仿300ul)。加入与上清同体积的异丙醇，轻柔混匀后室温静置10min。4℃，12000rpm
‑1离心15min，弃上清；
[0023]进一步地，在步骤(7)中，加入异丙醇通过
‑
OH的疏水作用破坏RNA的水化层，导致RNA析出沉降。
[0024]Step1:加入1mL75％的DEPC乙醇，上下颠倒7次，7500rpm
‑1离心5min，弃上清，重复步骤(Step1)；
[0025]Step2:加入1mL无水乙醇，上下颠倒7次，7500rpm
‑1离心5min，弃上清，重复步骤(Step2)；
[0026]Step3:室温干燥10min，50
‑
100uLRNA
‑
free水溶解。
[0027]进一步地，在步骤(8)中，采用核酸密度检测仪和1％的琼脂糖凝胶检测所提RNA的浓度和质量，一般评估RNA纯度的标准为：A260/A280比值为2.00
±
0.10，A260/A230的比值在2.00和2.40之间。
[0028]如果A260/A280比值小于2.00，说明样品中存在蛋白污染；如果A260/A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)菌体培养与收集；(2)反复洗涤菌体；(3)溶菌酶处理芽孢杆箘细胞壁；(4)液氮速冻；(5)加入RNAiso Plus震荡15min后放入100℃水浴锅中加热15
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25min；(6)氯仿提纯两次，并采用异丙醇沉淀；(7)采用75％的DEPC乙醇清洗沉淀2次后再用无水乙醇清洗2次。(8)采用核酸密度检测仪和1％的琼脂糖凝胶检测所提RNA的浓度和质量。2.根据权利要求1所述的适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法，其特征在于：在步骤(1)中，菌体培养与收集：液体培养：37℃，16h，至OD至1.0，取2
‑
4ml菌液，于2ml RNA
‑
free离心管中12000rpm
‑1离心1min，去除上清，收集菌体；平板培养：30℃，7天至对照TR4长至满板，5
‑
7天，用枪头挑取芽孢杆箘与TR4相邻的菌落边缘，至装有0.1％DEPC灭菌水的2ml RNA
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free离心管中，12000rpm
‑1离心1min，去除上清，收集菌体相同生长时期单独培养的芽孢杆箘作为对照。3.根据权利要求1所述的适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法，其特征在于：在步骤(2)中，灭菌水必须是经过0.1％的DEPC(焦碳酸二乙酯)在120℃高温高压条件下处理30分钟的；所述的0.1％DEPC灭菌水为2mL，0.1％DEPC灭菌水对收集的菌体进行反复清洗，清洗次数不少于4次；在步骤(2)中，反复洗涤菌体：向所收集的菌体加入2ml 0.1％DEPC水，12000rpm
‑1离心1min，去除上清，收集菌体；将步骤(2)重复3次。4.根据权利要求1所述的适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法，其特征在于：在步骤(3)中，溶菌酶处理芽孢杆箘细胞壁：向上述菌体加入1ml 0.1％DEPC水，重悬菌体，再加入40ul溶菌酶，至终浓度为4mg/ml，37℃摇床120rpm 3
‑
4h，12000rpm

【专利技术属性】
技术研发人员：李舒，番华彩，郑泗军，何平，徐胜涛，白亭亭，刘立娜，曾莉，李迅东，尹可锁，尚慧，郭志祥，
申请(专利权)人：云南省农业科学院农业环境资源研究所，
类型：发明
国别省市：