亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种亚洲型寨卡病毒RT‑RIA/CRISPR‑Cas12a检测试剂盒及其检测方法。所述的试剂盒包括用于亚洲型寨卡病毒RT‑RIA/CRISPR‑Cas12a检测的引物和探针序列，所述的引物和探针序列包括寨卡病毒ZIKV和内参基因β‑actin基因的RIA引物序列、Cas12a反应crRNA序列和荧光报告探针序列，crRNA序列5’端含有T7启动子识别位点，ZIKV和β‑actin基因荧光报告探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、ROX、VIC、CY5中一种，ZIKV和β‑actin基因荧光报告探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ1和BHQ2中的一种；且探针ZIKV和β‑actin的5’端标记的荧光基团均不相同；所述的试剂盒还包括：RIA反应试剂组分；Cas12a反应试剂组分；样本释放剂；所述的RIA反应试剂组分包括RIA Buffer、RIA酶和RIA激活剂；所述的Cas12a反应试剂组分包括Cas Buffer和Cas12a酶。

【技术实现步骤摘要】
亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及检测
,具体涉及一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
寨卡病毒(ZikaVirus，ZIKV)是一种重要的蚊媒病毒，属黄病毒科，黄病毒属，基因组为单股正链RNA，病毒颗粒直径40-50nm，传播媒介为伊蚊。截止2018年3月，全球范围内共有84个国家报道发现ZIKV感染病例。2016年2月我国确诊了中国大陆首例境外输入性ZIKV感染病例[1]，随后在广东、浙江、北京等地相继出现输入性病例[2]。该病毒在东南亚等地区有逐步蔓延的趋势。我国南方地区温暖潮湿极适合蚊子的生长繁殖，导致蚊媒传染病长期处于高发状态。世界卫生组织(WHO)认为，新生儿小头畸形、格林-巴利综合征(吉兰-巴雷综合征)可能与寨卡病毒感染有关[3]。由于寨卡病毒与登革病毒、西尼罗河病毒和黄热病毒等其他黄病毒会发生交叉反应，因此通过血清学方法诊断较为困难。建立快速、简便、灵敏的实验室核酸检测方法对及时进行临床诊断救治、开展流行病学调查具有重要意义。核酸恒温扩增技术由于不需反复热变性，无需特殊仪器，反应速度更快，适合现场快速检测，在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用[4]。目前已有10余种核酸恒温扩增技术，其中重组聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，RPA)是2006年由英国公司TwistDxInc研发的一种核酸恒温扩增技术[5]，具有灵敏度高、特异性强、操作快速便捷等优点，而且可以实现定量分析，因此在疾病诊断和病原鉴定等许多领域具有广阔的应用前景，已在动物疫病检测如口蹄疫病毒[6]、小反刍兽疫病毒[7]、猪细小病毒[8]、牛病毒性腹泻[9]的检测和病毒性出血热检测[10]如马尔堡病毒、埃博拉病毒、登革病毒、黄热病毒和天花病毒的检测上得到应用。虽然RPA扩增可结合探针进行实时荧光定量PCR检测，但该方法对引物探针组合筛选要求极高，相较于目前市场上的实时荧光定量PCR方法，并未实质性地提升检测灵敏度。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR)的简称，Cas是CRISPR相关蛋白(CRISPRassociatedprotein，Cas)的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统CRISPR-Cas检测系统。Gootenberg等[11-13]先后建立了基于cas13a的特异性高灵敏度酶报告系统(specifichigh-sensitivityenzymaticreporterunlocking，SHERLOCK)和不经核酸提取热处理样品灭活核酸酶技术(heatingunextracteddiagnosticsamplestoobliteratenucleases，HUDSON)检测平台。Chen等[14]基于Cas12a建立了DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告检测系统(DNAendonucleasetargetedcrisprtransreporter，DETECTR)，并且实现了单分子级别的灵敏度。说明CRISPR技术已经在分子诊断技术中得到了一定的应用。本专利技术基于国境口岸对寨卡病毒防控的需求，以简单、即时、高灵敏检测为目标，开发出一套基于RT-RIA/CRISPR-Cas12a荧光检测技术的寨卡病毒检测试剂及其方法，为蚊媒传染病疫情的检测与监测提供一种可选的方法。
技术实现思路
针对
技术介绍
中提出的问题，本专利技术提出一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒及其检测方法，包括一种基于RT-RIA/CRISPR-Cas12a荧光检测引物探针组、试剂盒及其检测方法。下述ZIKV即为寨卡病毒的简称；RIA反应、RT-RIA反应表示均为同一体系；Cas、Cas12a、CRISPR-Cas12a反应表示均为同一体系；下述crRNA与CrRNA为同一物质；为了实现以上目的，本专利技术采用的技术方案为：一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，包括用于亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测的引物和探针序列，所述的引物和探针序列包括寨卡病毒ZIKV和内参基因β-actin基因的RIA引物序列、Cas12a反应crRNA序列和荧光报告探针序列，ZIKVRIA引物的核苷酸序列如下所示：引物ZIKV-F：5’-TTGAGGGAGAGTTCAAGCTTAGGACGGAGCAA-3’，(SEQIDNO：1)；引物ZIKV-R：5’-GAGATGCGACCTGATAGGCCAGCCAAACAGGA-3’，(SEQIDNO：2)；引物β-actin-F：5’-TGGATCAGCAAGCAGGAGTATGACGAGTCCGG-3’，(SEQIDNO：3)；引物β-actin-R：5’-CATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGGTTTTGTC-3’，(SEQIDNO：4)；crRNA序列5’端含有T7启动子识别位点，核苷酸序列如下所示：ZIKV-crRNA：5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGATgacctttgtggaactcatgaaaagaggagatctt-3’，(SEQIDNO：5)；β-actin-crRNA：5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGATcggtggacgatggaggggccgg-3’，(SEQIDNO：6)；荧光报告探针核苷酸序列如下所示：ZIKV-P：5’-TTATT-3’，(SEQIDNO：7)；β-actin-P：5’-TTAATT-3’，(SEQIDNO：8)；ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、ROX、VIC、CY5中一种，ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ1和BHQ2中的一种；且探针ZIKV和β-actin的5’端标记的荧光基团均不相同；所述的试剂盒还包括：(1)RIA反应试剂组分；(2)Cas12a反应试剂组分；(3)样本释放剂；所述的RIA反应试剂组分包括RIABuffer、RIA酶和RIA激活剂；所述的Cas12a反应试剂组分包括CasBuffer和Cas12a酶。进一步的，ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列的5’端分别标记FAM和VIC荧光素，ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列3’端均标记BHQ1淬灭基团。进一步的，RIA反应体系中，ZIKV和β-actin基因引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，包括用于亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测的引物和探针序列，所述的引物和探针序列包括寨卡病毒ZIKV和内参基因β-actin基因的RIA引物序列、Cas12a反应crRNA序列和荧光报告探针序列，其特征在于：/nZIKV RIA引物的核苷酸序列如下所示：/n引物ZIKV-F：/n5’-TTGAGGGAGAGTTCAAGCTTAGGACGGAGCAA-3’，(SEQ ID NO：1)；/n引物ZIKV-R：/n5’-GAGATGCGACCTGATAGGCCAGCCAAACAGGA-3’，(SEQ ID NO：2)；/n引物β-actin-F：/n5’-TGGATCAGCAAGCAGGAGTATGACGAGTCCGG-3’，(SEQ ID NO：3)；/n引物β-actin-R：/n5’-CATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGGTTTTGTC-3’，(SEQ ID NO：4)；/ncrRNA序列5’端含有T7启动子识别位点，核苷酸序列如下所示：/nZIKV-crRNA：/n5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGATgacctttgtggaactcatgaaaagaggagatctt-3’，(SEQ ID NO：5)；/nβ-actin-crRNA：/n5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGATcggtggacgatggaggggccgg-3’，(SEQ ID NO：6)；/n荧光报告探针核苷酸序列如下所示：/nZIKV-P：/n5’-TTATT-3’，(SEQ ID NO：7)；/nβ-actin-P：/n5’-TTAATT-3’，(SEQ ID NO：8)；/nZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、ROX、VIC、CY5中一种，ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ1和BHQ2中的一种；且探针ZIKV和β-actin的5’端标记的荧光基团均不相同；/n所述的试剂盒还包括：/n(1)RIA反应试剂组分；/n(2)Cas12a反应试剂组分；/n(3)样本释放剂；/n所述的RIA反应试剂组分包括RIA Buffer、RIA酶和RIA激活剂；/n所述的Cas12a反应试剂组分包括Cas Buffer和Cas12a酶。/n...

【技术特征摘要】
1.一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，包括用于亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测的引物和探针序列，所述的引物和探针序列包括寨卡病毒ZIKV和内参基因β-actin基因的RIA引物序列、Cas12a反应crRNA序列和荧光报告探针序列，其特征在于：
ZIKVRIA引物的核苷酸序列如下所示：
引物ZIKV-F：
5’-TTGAGGGAGAGTTCAAGCTTAGGACGGAGCAA-3’，(SEQIDNO：1)；
引物ZIKV-R：
5’-GAGATGCGACCTGATAGGCCAGCCAAACAGGA-3’，(SEQIDNO：2)；
引物β-actin-F：
5’-TGGATCAGCAAGCAGGAGTATGACGAGTCCGG-3’，(SEQIDNO：3)；
引物β-actin-R：
5’-CATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGGTTTTGTC-3’，(SEQIDNO：4)；
crRNA序列5’端含有T7启动子识别位点，核苷酸序列如下所示：
ZIKV-crRNA：
5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGATgacctttgtggaactcatgaaaagaggagatctt-3’，(SEQIDNO：5)；
β-actin-crRNA：
5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGATcggtggacgatggaggggccgg-3’，(SEQIDNO：6)；
荧光报告探针核苷酸序列如下所示：
ZIKV-P：
5’-TTATT-3’，(SEQIDNO：7)；
β-actin-P：
5’-TTAATT-3’，(SEQIDNO：8)；
ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、ROX、VIC、CY5中一种，ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ1和BHQ2中的一种；且探针ZIKV和β-actin的5’端标记的荧光基团均不相同；
所述的试剂盒还包括：
(1)RIA反应试剂组分；
(2)Cas12a反应试剂组分；
(3)样本释放剂；
所述的RIA反应试剂组分包括RIABuffer、RIA酶和RIA激活剂；
所述的Cas12a反应试剂组分包括CasBuffer和Cas12a酶。


2.根据权利要求1所述的一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，其特征在于：ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列的5’端分别标记FAM和VIC荧光素，ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列3’端均标记BHQ1淬灭基团。


3.根据权利要求1所述的一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，其特征在于，RIA反应体系中，ZIKV和β-actin基因引物终浓度为400nmol/L；Cas12a反应体系中crRNA浓度为70nmol/L，荧光报告探针浓度为500nmol/L。


4.根据权利要求1所述的一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，其特征在于：RIA反应和Cas12a反应条件相同，均为42℃下进行反应，其中，RIA反应时间...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈峰，吴海磊，唐晓宇，杨国平，
申请(专利权)人：南通海关综合技术中心江苏国际旅行卫生保健中心南通分中心，南通海关口岸门诊部，
类型：发明
国别省市：江苏;32