一种基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法和应用技术

本发明专利技术属于生物快速检测技术领域，具体涉及一种基于DNA‑多肽探针技术定量核酸的质谱方法，包括如下步骤：以待测核酸的核苷酸序列为基础，设计DNA探针；筛选出特征多肽，并与所述DNA探针构建DNA‑多肽探针；将DNA‑多肽探针与待测核酸杂交；将杂交后的DNA‑多肽探针进行蛋白酶酶解，将DNA‑多肽探针中的特征多肽水解为报告肽；构建报告肽的LC‑MS/MS检测方法；利用构建的LC‑MS/MS检测方法对报告肽的浓度进行检测；由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数，实现对待测核酸的定量检测。基于上述方法，将核酸的定量转换为多肽的定量，具有检测效率高、特异性强的优势；此外，通过该方法对肝癌标志物HULC进行检测，更有利于对肝癌进行风险评估。

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法和应用
本专利技术属于生物快速检测
，具体涉及一种基于DNA-多肽探针技术的lncRNA质谱定量的方法和应用。
技术介绍
长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。随着研究的逐步深入，lncRNA的功能逐渐被研究者发掘，其与肿瘤的发生发展密切相关。而HULC是在肝癌中发现最早的lncRNA，研究发现HULC在肝癌患者中显著升高，且可参与调控肝癌发生的分子机制，有望成为肝癌诊断的潜在生物学标志物。目前定量检测lncRNA的方法主要有荧光染料法、Northern印迹分析、微阵分析(microarray)、紫外分光光度法和实时定量PCR(quantitativeReal-TimePCR，qRT-PCR)等。荧光染料法试剂价格高、稳定性较差，Northern印迹和微阵分析分析时间长且动态范围窄，紫外分光光度法灵敏度低只能测定总核酸量，且易受到被检样品中其他杂质的干扰。qRT-PCR是目前核酸拷贝数定量的主要技术，该技术通过在PCR反应体系中加入荧光结合染料(SYBRgreenI)或荧光标记的探针(如TaqManProbes)，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程通过标准曲线知模板进行定量分析。qRT-PCR需要的样本较少，但qRT-PCR技术通常需要对目标RNA进行预扩增以及进一步的荧光团标记步骤，而样品间背景的不同将影响PCR的扩增效率和响应，荧光染料的淬灭会影响信号收集从而引入偏差。目前尚无一种可直接特异检测lncRNA的定量方法，因此，开发能够以灵敏和直接的方式提供lncRNAs定量结果的新策略势在必行。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法，对核酸的检测具有较高的检测效率和检测特异性；利用本专利技术构建的核酸质谱定量检测方法对肝癌标志物HULC在肝细胞中的拷贝数进行检测，用于肝癌风险评估，作为本专利技术的第二个目的。基于上述目的，本专利技术采用如下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法，包括如下步骤：(1)以待测核酸的核苷酸序列为基础，设计DNA探针；筛选出特征多肽，并与DNA探针构建DNA-多肽探针；(2)将由步骤(1)构建的DNA-多肽探针与待测核酸杂交；(3)将杂交后的DNA-多肽探针进行蛋白酶酶解，将DNA-多肽探针中的特征多肽水解为报告肽；(4)构建报告肽的LC-MS/MS检测方法；(5)利用LC-MS/MS检测方法对报告肽的浓度进行检测；(6)由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数，实现对待测核酸的定量检测。本专利技术通过待测核酸与DNA-多肽探针的偶联，通过将核酸的定量转移为特征多肽的定量；由于DNA探针与待测核酸的碱基序列互补配对，使得对核酸的检测具有高度特异性；此外，通过HPLC-MS/MS对特征多肽的高效、精准的定量检测，实现对RNA的精准定量，解决了现有RNA定量方法存在的非特异性和精度低的问题。进一步地，步骤(1)中DNA-多肽探针的具体构建过程如下：A.将设计的DNA探针合成为5’端含有二硫键修饰的DNA探针；B.将二硫键修饰的DNA探针中的二硫键进行还原；C.将二硫键还原后的DNA探针与等量的马来酰亚胺修饰的特征多肽偶联反应，制得DNA-多肽探针。本专利技术通过构建DNA-多肽探针，借助DNA-多肽探针中的DNA探针与待测核酸的特异性杂交，形成含有待测核酸的DNA-多肽探针，借助多肽探针中的多肽经水解后能够利用HPLC-MS/MS进行精确定量，使得本专利技术构建的DNA探针能够将待测核酸的定量转换为多肽的定量，解决现有核酸无法实现精准定量的问题。进一步地，步骤(2)中DNA-多肽探针与待测核酸的杂交过程如下：I.将生物素标记的待测核酸与链霉亲和素磁珠重悬孵育形成生物素化待测核酸；II.将生物素化待测核酸与DNA-多肽探针按照摩尔比1:1混合，进行杂交孵育制得含有待测核酸的DNA-多肽探针。通过将生物素标记的核酸与链霉亲和素磁珠孵育形成生物素化待测核酸，借助生物素-链霉亲和素放大系统，使得DNA-多肽探针能够与待测核酸按照摩尔比1:1特异性结合，使得将待测核酸的定量转移为DNA-多肽探针上的多肽的定量成为可能。进一步地，上述待测核酸为lncRNA。进一步地，上述lncRNA为HULC。进一步地，上述DNA-多肽探针中DNA探针的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；DNA-多肽探针中的特征多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；报告肽的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。进一步地，基于LC-MS/MS检测报告肽的质谱参数如下：一级质谱m/z为487.3；二级质谱m/z为690.3。本专利技术通过对特征多肽报告肽的不同离子对的响应进行分析，选取一级质谱的m/z为487.3，二级质谱m/z为690.3，在进行HPLC-MS/MS检测过程中，色谱图的基线更为平稳，利用对报告肽出峰的面积进行计算时，使得计算结果更为准确，即通过选取上述离子对，有利于提高对特征多肽报告肽的检测精度。进一步地，步骤(6)由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数的具体换算关系为：待测核酸的拷贝数(copies/L)＝3.78×1021×xmol/L，其中，xmol/L表示经LC-MS/MS检测得到的报告肽的摩尔浓度。上述公式的具体推导过程如下：以经LC-MS/MS检测得到的报告肽的浓度记为xmol/L，理论上报告肽和探针及HULC的比例是1：1：1，故报告肽的摩尔浓度等同于HULC的摩尔浓度，即当报告肽的检测摩尔浓度为xmol/L时，HULC的摩尔浓度为xmol/L，则由HULC的摩尔浓度xmol/L推导出HULC的拷贝数(copies/L)，具体换算关系如下：HULC的拷贝数(copies/L)＝6.02×1023(copies/mol)×103×HULC的摩尔浓度(mol/L)/(HULC碱基数×平均分子量MW)＝6.02×1023(copies/mol)×103×HULC的摩尔浓度(mol/L)/(482×330)＝3.78×1021(copies/L)×HULC的摩尔浓度(mol/L)＝3.78×1021×xmol/L。其中，MW＝碱基数*330，HULC碱基数＝482。第二方面，本专利技术提供了一种利用上述定量核酸的质谱方法在肝癌检测中的应用。进一步地，上述应用具体为利用基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法对肝细胞中的HULC拷贝数进行检测。与现有技术相比，本专利技术的技术效果如下：(1)本专利技术基于迈克尔加成反应将巯基修饰的DNA探针与马来酰亚胺修饰的特征多肽进行偶联形成DNA-多肽探针，借助DNA-多肽探针中的DNA探针与待测核酸的碱基序列互补配对，使得对核酸的检测具有高度特异性；借助DNA-多肽探针中的特征多本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)以待测核酸的核苷酸序列为基础，设计DNA探针；筛选出特征多肽，并与所述DNA探针构建DNA-多肽探针；/n(2)将由步骤(1)构建的DNA-多肽探针与待测核酸杂交；/n(3)将杂交后的DNA-多肽探针进行蛋白酶酶解，将DNA-多肽探针中的特征多肽水解为报告肽；/n(4)构建报告肽的LC-MS/MS检测方法；/n(5)利用LC-MS/MS检测方法对报告肽的浓度进行检测；/n(6)由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数，实现对待测核酸的定量检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以待测核酸的核苷酸序列为基础，设计DNA探针；筛选出特征多肽，并与所述DNA探针构建DNA-多肽探针；
(2)将由步骤(1)构建的DNA-多肽探针与待测核酸杂交；
(3)将杂交后的DNA-多肽探针进行蛋白酶酶解，将DNA-多肽探针中的特征多肽水解为报告肽；
(4)构建报告肽的LC-MS/MS检测方法；
(5)利用LC-MS/MS检测方法对报告肽的浓度进行检测；
(6)由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数，实现对待测核酸的定量检测。


2.根据权利要求1所述基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法，其特征在于，所述步骤(1)中DNA-多肽探针的具体构建过程如下：
A.将设计的DNA探针合成为5’端含有二硫键修饰的DNA探针；
B.将二硫键修饰的DNA探针中的二硫键进行还原；
C.将二硫键还原后的DNA探针与等量的马来酰亚胺修饰的特征多肽偶联反应，制得DNA-多肽探针。


3.根据权利要求2所述基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法，其特征在于，所述步骤(2)中DNA-多肽探针与待测核酸的杂交过程如下：
I.将生物素标记的待测核酸与链霉亲和素磁珠重悬孵育形成生物素化待测核酸；
II.将生物素化待测核酸与DNA-多肽探针按照摩尔比1:1混合，进行杂交孵育制得含有待测核酸的DNA-多肽探针。


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【专利技术属性】
技术研发人员：黄宪章，张乔轩，蔡志梁，韩丽乔，严君，展敏，欧阳芬，王建兵，柯培锋，庄俊华，
申请(专利权)人：广东省中医院广州中医药大学第二附属医院，广州中医药大学第二临床医学院，广东省中医药科学院，
类型：发明
国别省市：广东;44