【技术实现步骤摘要】
适用于高通量转录组空间位置信息的检测方法及其应用
本专利技术涉及高通量原位杂交领域，具体涉及一种适用于高通量转录组空间位置信息的检测方法及其应用。
技术介绍
细胞学说的提出为科学家们对生命体的结构和功能以及其运转机制的研究奠定了基础。随着研究的深入，人们发现机体中同一组织来源的细胞也会存在基因组、表观基因组以及转录组上的差异；因此基于单细胞水平的研究尤为重要，应运而生的单细胞测序技术实现了在单个细胞水平上面对转录组或基因组进行扩增并测序。继人类基因组计划的浪潮之后人类细胞生物分子图谱计划(HumanBioMolecularAtlasProgramHuBMAP)和细胞图谱项目蓄势待发。单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术让我们对细胞群的异质性、发育过程的动力学、疾病的发生发展以及细胞功能的调控机制都有了更深程度的理解。单个细胞是如何协调周围的多个细胞发挥功能仅仅依靠单个细胞的身份信息是远远不够的，需要借助新的方法来展示每个细胞的空间位置关系。运用生物信息学的方法对RNAseq数据中单个细胞的转录组进行聚类分析。由...
【技术保护点】
1.一种适用于高通量转录组空间位置信息的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：/n1)杂交探针的设计/n从待检测细胞或组织的RNA序列中筛选出杂交效率高、特异性强、无RNA高级结构的靶序列区域设计杂交探针，其中，所述杂交探针由锁式探针和RCA引发探针组成；/n2)探针预处理/n对杂交探针中锁式探针的5’端进行磷酸化处理；/n3)样品杂交/n在待检测样本上制备一个反应腔室，用多聚甲醛对进行固定，然后用甲醇进行脱水和变性处理，再将含有杂交探针的缓冲液加入到反应腔室中过夜孵育；/n4)连接反应/n将连接酶反应体系加入到反应腔室中进行连接反应，使锁式探针与对应RNA上的靶序列互补配对...
【技术特征摘要】
1.一种适用于高通量转录组空间位置信息的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)杂交探针的设计
从待检测细胞或组织的RNA序列中筛选出杂交效率高、特异性强、无RNA高级结构的靶序列区域设计杂交探针，其中，所述杂交探针由锁式探针和RCA引发探针组成；
2)探针预处理
对杂交探针中锁式探针的5’端进行磷酸化处理；
3)样品杂交
在待检测样本上制备一个反应腔室，用多聚甲醛对进行固定，然后用甲醇进行脱水和变性处理，再将含有杂交探针的缓冲液加入到反应腔室中过夜孵育；
4)连接反应
将连接酶反应体系加入到反应腔室中进行连接反应，使锁式探针与对应RNA上的靶序列互补配对形成半闭合的环状结构；
5)滚环扩增
RCA引发探针同时与RNA上的靶序列和锁式探针互补，Phi29DNA聚合酶以RCA引发探针为引物，以锁式探针的环状结构为模板进行滚环扩增，进一步放大信号；
6)原位解读空间信息
i.原位显色解读空间信息：
将含有与滚环扩增产物显色序列反向互补的荧光探针杂交体系加入上述反应腔室中进行杂交原位显色，然后对待检测样本的研究区域进行成像，解读RNA空间位置信息；
ii.barcode测序及数据分析，解读高通量转录组的空间信息：
a.将连接酶反应体系加入反应腔室中进行连接测序反应，然后对锁式探针中barcode的第一位碱基序列进行测序，按待检测样本特征对研究区域进行逐层成像扫描，叠加各层信号进行最大投影，注册解读每个荧光信号信息对应barcode信息；
b.同法依次解读锁式探针中barcode第二位、第三位碱基序列信息；
c.对上述获得的3轮测序信息进行配准、barcode过滤、细胞分割；然后依次进行单细胞数据分析、基因的表达值进行表达矩阵的标准化和聚类分析，通过归一化和标准化处理对基因集进行降维聚类，根据不同细胞标记物对细胞群进行分类以及更细的亚分群，以确定特殊的细胞群，最终进行表达型的分析。
2.根据权利要求1所述适用于高通量转录组空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述步骤1)中，RNA序列的靶序列由3段连续的靶序列A、B和C组成，且所述锁式探针由5’端至3端’为A’序列，loop序列和B’序列，所述A’序列和B’序列分别与靶序列A、靶序列B互补，故所述锁式探...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹罡，戴金霞，吴小凤，徐伟泽，王忠超，李月，王昊棋，高安然，张凌凯，
申请(专利权)人：华中农业大学，鲲羽生物科技江门有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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