总胆汁酸检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及TBA检测试剂盒，其包括第一试剂，所述第一试剂含有Thio‑NAD；第二试剂，所述第二试剂含有NADH、3α‑HSD、非离子表面活性剂和抗生素类防腐剂。通过非离子表面活性剂和抗生素类表面活性剂的组合，本发明专利技术延长了TBA循环酶法检测试剂的保存时长且不易造成试剂稳定性的下降。此外，本发明专利技术还涉及检测TBA的方法。

【技术实现步骤摘要】
总胆汁酸检测试剂盒及方法
本专利技术涉及总胆汁酸检测领域，具体涉及基于循环酶法检测胆汁酸的试剂。
技术介绍
总胆汁酸(Totalbileacids,TBA)是胆甾醇在肝内分解及肠肝循环中胆甾酸代谢产物的总称，是机体内胆固醇代谢的主要终产物，也是胆汁的重要成分，在脂肪代谢中起着重要作用。正常人的血液中，TBA水平极微，而当肝细胞中TBA代谢异常时，TBA反流入血，从而发生血清中TBA升高的现象。因此，可将血清中TBA水平与多项肝酶学指标结合，可以对慢性肝病、肝硬化、酒精性肝病以及胆汁淤积的发生、进展和预后进行辅助判断。目前临床使用的TBA检测试剂盒有酶比色法和循环酶法。其中酶比色法的反应原理为3α-羟基胆汁酸在NAD+的存在下由3α-羟类固醇脱氢酶催化生成3-酮基胆汁酸和NADH，NADH与四唑氮蓝(NBT)在黄递酶作用下生成稳定蓝色染料，随后通过比色测定确定总胆汁酸浓度。然而，一方面，酶比色法易受到血清中乳酸脱氢酶等物质的干扰；另一方面，大多数自动分析仪上无法去除样本空白的干扰。循环酶法是另一种常用的TBA检测方法，其避免了酶比色法存在的上述缺陷，能够实现便捷、准确度高的检测。循环酶法的反应原理为胆汁酸会被3-羟甾醇脱氢(3-HSD)以及β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD)氧化，生成3-酮类固醇以及β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(Thio-NADH)。而生成的3-酮类固醇会在3-HSD及NADH存在下，生成胆汁酸及NAD。按照上述循环，微量的胆汁酸量被逐步放大，通过测定单位时间内生成的Thio-NADH在405nm处的吸光度变化，可计算出胆汁酸的浓度。循环酶法的TBA试剂中含有大量NADH，为了维持NADH的稳定性需将pH调至碱性，在此pH条件下，生化试剂中常用防腐剂的防腐效果将减弱甚至失去防腐效果，从而大大缩短了试剂的保存时长。即便少数防腐剂在此pH条件下防腐效果较好，但其对酶活影响较大，会造成试剂稳定性下降，不宜用于在基于循环酶法的TBA检测体系中。据此，在TBA检测领域，存在着在延长含NADH试剂的保存时长的同时保持反应体系酶活的强烈需求。
技术实现思路
如上文所述，循环酶法是一种常用的、能准确血清中TBA的方法，其中NADH是循环酶法中必要的反应成分。由于NADH需要在碱性条件下，导致大多数常见的防腐剂无法很好地发挥作用。虽然一些防腐剂在碱性条件下仍具有防腐效果，但会影响循环酶法反应体系中酶的活性，造成试剂稳定性的下降。也就是说，在目前的基于循环酶法的TBA检测试剂中，一方面，难以获得优异的试剂的保存效果，另一方面，优异的保存效果与试剂的稳定性无法兼顾。为解决上述问题，本专利技术中对循环酶法的TBA检测试剂进行了研究，意外地发现将非离子表面活性剂与抗生素类防腐剂同时加入到含NADH的TBA检测试剂中，能够兼顾保存效果与体系稳定性的试剂盒，从而完成本专利技术。据此，在第一方面，本专利技术提供了一种试剂盒，包括：第一试剂，其含有Thio-NAD、pH调节剂和防腐剂，任选地，所述pH调节剂将pH调节至3～4.5；第二试剂，其含有NADH、3α-HSD、缓冲液、非离子表面活性剂和抗生素类防腐剂，任选地，所述缓冲液的pH为8～10。在一些实施方式中，所述非离子表面活性剂为Tween系列，例如Tween20、Tween60和Tween80等中的一种或更多种。在一些实施方式中，所述非离子表面活性剂为Triton系列，例如TritonX-100和TritonX-114等中的一种或更多种。在一些实施方式中，所述非离子表面活性剂为Tertigol。在一些实施方式中，所述抗生素类防腐剂选自红霉素、青霉素、那他霉素和头孢噻肟钠盐中的一种或更多种。在具体的实施方式中，所述抗生素类防腐剂为红霉素。在具体的实施方式中，所述抗生素类防腐剂为青霉素。在具体的实施方式中，所述抗生素类防腐剂为头孢噻肟钠盐。在一些实施方式中，所述Tween系列的浓度约为约1～8g/L，例如为约3～8g/L。在一些实施方式中，所述Triton系列的浓度为约2～8g/L，例如为约3～5g/L。在一些实施方式中，所述Tertigol的浓度为约0.5～2.5g/L，优选约0.5～1.5g/L。在一些实施方式中，所述抗生素类防腐剂的浓度为约0.1～1.5g/L，优选为约0.2～1g/L。在第二方面，本专利技术还提供了一种检测TBA中方法，包括以下步骤：1)将待测样本与本专利技术的第一试剂混匀并孵育；2)加入本专利技术的第二试剂混匀并孵育；3)测定第一吸光度；4)2～4分钟后，测定第二吸光度；以及5)根据所述第一吸光度和第二吸光度计算TBA浓度。在第三方面，还提供了本专利技术的第二试剂在制备检测TBA的试剂盒中的用途。本专利技术中对循环酶法的TBA检测试剂进行改进，将非离子表面活性剂与抗生素类防腐剂同时加入到含NADH的TBA检测试剂中，获得的试剂具有能够兼顾保存效果与体系稳定性等优点。具体实施方式下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本专利技术，本专利技术的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本专利技术，而非限制本专利技术。在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。TBA检测试剂中有机物含量较高，特别容易受到微生物的影响，例如微生物使酶分解，造成酶的活性降低，甚至失活，从而造成试剂不稳定；试剂中的反应物NADH特定的保存条件使得多数防腐剂难以较好发挥作用。而原材料生产或试剂调配过程中不可避免的会引入一些微生物。因此找到一种能够有效起到防腐效果又不造成试剂稳定性下降的物质或者组合尤其重要。基于循环酶法TBA的检测体系，并针对含NADH试剂的保存的特殊条件，本专利技术提供了一种TBA的试剂盒，该试剂盒包括含Thio-NAD的第一试剂以及含有NADH、3α-HSD的第二试剂，其中，第二试剂中还同时添加有非离子表面活性剂和抗生素类防腐剂。在优选的实施方式中，本专利技术的非离子表面活性剂选自Tween系列、Triton系列和Tertigol。需要说明的是，Tween系列、Triton系列和Tertigol具有相同的亲水基团，即聚氧乙烯亲水基团，仅是疏水基团不同。亲水基团使得它们在作为表面活性剂时能发挥相似的作用，不希望受到理论的束缚，例如，这样的表面活性剂与试剂中3α-HSD分子结合，使其三维结构不易受到破坏，维持其稳定性。如本专利技术所使用的，术语“防腐剂”是指用来延长试剂保存时间的物质。而“抗生素类防腐剂”是指用来延长试剂保存时间的属于抗生素类的物质。具体地，非离子表面活性剂可以选择Tertigol。在本专利技术中Tertig本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测TBA的试剂盒，包括：/n第一试剂，其含有Thio-NAD、pH调节剂和防腐剂，任选地，所述pH调节剂将pH调节至3～4.5；/n第二试剂，其含有NADH、3α-HSD、缓冲液、非离子表面活性剂和抗生素类防腐剂，任选地，所述缓冲液的pH为8～10。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测TBA的试剂盒，包括：
第一试剂，其含有Thio-NAD、pH调节剂和防腐剂，任选地，所述pH调节剂将pH调节至3～4.5；
第二试剂，其含有NADH、3α-HSD、缓冲液、非离子表面活性剂和抗生素类防腐剂，任选地，所述缓冲液的pH为8～10。


2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述非离子表面活性剂选自Tween系列、Triton系列和Tertigol中的一种或多种。


3.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述Tween系列选自Tween20、Tween60和Tween80中的一种或多种。


4.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述Triton系列选自TritonX-100和TritonX-114中的一种或多种。


5.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗生素类防腐剂选自红霉素、青霉素、那他霉素和头孢噻肟钠盐中的一种或多种...

【专利技术属性】
技术研发人员：程文理，
申请(专利权)人：深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44