利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法技术

本发明专利技术公开了利用FAD依赖型D‑2‑羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D‑2‑羟基戊二酸的方法，涉及酶法检测技术领域，该方法利用FAD依赖型D‑2‑羟基戊二酸脱氢酶、刃天青和PBS缓冲液，实现D‑2‑羟基戊二酸的检测；所述FAD依赖型D‑2‑羟基戊二酸脱氢酶为AX‑F‑D2HGDH蛋白或P‑D2HGDH蛋白；本发明专利技术的检测方法组成成分更加简单，成本更低，操作更为简便；由于无需添加辅因子、辅酶或心肌黄酶，因此引入的干扰少，灵敏度更高，并且仅需制备一种酶，无需添加外源辅因子NAD等，同时缓冲液可采用成本更低且易于获取的PBS缓冲液，因此成本更加低廉。

【技术实现步骤摘要】
利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法
本专利技术涉及酶法检测
，具体说是利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法。
技术介绍
2-羟基戊二酸(2-Hydroxyglutarate，2-HG)一般是2-酮基戊二酸的还原产物，2-HG分子中含有一个不对称碳原子，按其旋光性分为D-2-羟基戊二酸(D-2-HG或R-2-HG)和L-2-羟基戊二酸(L-2-HG或S-2-HG)，生物体内负责催化D-2-HG氧化成2-酮基戊二酸的酶为D-2-羟基戊二酸脱氢酶(D-2-hydroxyglutaratedehydrogenase；D2HGDH)。有文献报道，70kg的成人其D2HGDH每天可分解40毫摩尔D-2-HG。D2HGDH编码基因突变会引起D-2-HG浓度升高，造成D-2-羟基戊二酸酸血症(D-2-HGA)，D-2-HGA是一种常染色体隐形遗传疾病，患者早年即出现癫痫、张力减退、发育迟缓及神经功能损害等，预后不良；D-2-HGA分为I型和II型，D2HGDH编码基因突变和异柠檬酸脱氢酶(IDH)编码基因突变分别是I型和II型D-2-HGA发生的分子机理。人体D2HGDH共价结合FAD作为辅因子，能够以D-2-HG及D-乳酸为底物，以电子转移黄素蛋白(electrontransferringflavoprotein；简称为ETF)为自然电子受体。在本申请中将这种共价结合FAD为辅因子D2HGDH称之为FAD-依赖型的D2HGDH，简称为F-D2HGDH。D-2-HGA患者体液D-2-HG含量比健康人高出30-840倍(约26-757μM)。D-2-HG是病理发生的关键，且疾病严重性与D-2-HG浓度密切相关。研究显示，高浓度D-2-HG具有细胞和神经毒力；D-2-HG的积累可下调肌酸激酶、复合体IV和复合体V的表达；诱导氧化应激，破坏线粒体能量代谢等。同时在酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、二氢硫辛酸脱氢酶缺乏症、丙酮酸脱氢酶缺乏症等多种代谢障碍性疾病中，D-2-HG浓度也有升高。血液或尿液中含高浓度的D-2-HG是D-2-HGA的生化标志，因此开发灵敏准确的D-2-HG检测方法对于此类疾病诊断具有重要意义。另外，近年来在急性髓细胞样白血病、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤等多种肿瘤中检测到异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变，IDH突变可导致该蛋白产生催化2-酮戊二酸还原生成D-2-HG的活力，造成D-2-HG积累。D-2-HG是包括组蛋白脱甲基化酶在内的众多2-酮戊二酸依赖的双加氧酶的竞争性抑制剂，其积累可导致基因组范围内的组蛋白和DNA改变、阻止细胞分化，最终导致癌症的发生。D-2-HG作为IDH突变导致瘤发生的关键因素，也因此被认为是一种促癌发生物。因此D-2-HG作为标志物的临床应用价值引起人们广泛重视，例如D-2-HG可作为替代标志物，预测IDH突变，同时相比于下一代测序方法，检测D-2-HG灵敏且快速，且可防止基因测序方法造成IDH突变假阴性，D-2-HG可以作为胶质瘤分型标志物，在急性髓性细胞白血病、乳腺癌中作为诊断、预后及治疗监测性指标等。目前对于组织及体液中D-2-HG浓度的测定，主要通过液相色谱-质谱连用(LC-MS)或者气相色谱-质谱连用(GC-MS)来实现；核磁方法主要用于非侵入性检测胶质瘤等组织内D-2-HG。另外，测量两种代谢物的总量可能会导致错误的结论，因此在临床与科学研究中，分别测定D-2-HG与L-2-HG是准确诊断2-HG相关疾病的前提，比测定两者的总量更加具有说服力，目前采用方法主要是采用手性分离柱或者通过手性衍生化样品来实现D-2-HG和L-2-HG的分离。上述检测方法面临着成本较高、耗费大量劳动、步骤繁琐、难以高通量等缺点。与F-D2HGDH不同的是，在某些厌氧菌中，例如Acidaminococcusfermentans，存在NAD依赖型的D-2-羟基戊二酸脱氢酶(NAD-dependentD-2-hydroxyglutaratedehydrogenase；命名为HgdH)，HgdH有时候也被人称做D2HGDH，为避免与传统概念常说的F-D2HGDH混淆，因此在本申请中HgdH也被命名为N-D2HGDH。生物体内N-D2HGDH的主要功能为还原2-KG为D-2-HG，同时氧化NADH为NAD。但在体外，如果存在其他酶偶联反应推动的情况下，N-D2HGDH反应也可以朝着D-2-HG向2-酮基戊二酸转变的方向进行。专利技术专利CN201380011978.1测定(D)2羟基戊二酸(D2HG)或(D)2羟基己二酸的工具和方法，利用NAD依赖型脱氢酶-心肌黄酶-刃天青的组合开发了一种检测D-2-HG的方法，具体是利用N-D2HGDH和心肌黄酶的偶联反应才能实现最终将电子传递给刃天青产生荧光，实现D-2-HG的检测。但是该方法由于是两步反应(第一步反应为N-D2HGDH催化D-2-HG氧化，同时还原NAD产生NADH；第二步反应为心肌黄酶氧化NADH，同时还原刃天青)，检测时影响结果的因素较多，两者催化两步反应偶联才能实现最终电子传递给刃天青产生荧光，引入的干扰多，灵敏度偏低；检测体系需要使用两种酶，并需要添加价格较高的辅因子NAD，检测成本较高；另外，该NAD依赖型脱氢酶除了对D-2-HG有活性外，对D-2-羟基己二酸也有活性，检测用酶的底物专一性不好，检测中有面临干扰的风险。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的是提供利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青一步法检测D-2-羟基戊二酸的方法及应用。本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶、刃天青和PBS缓冲液，实现D-2-羟基戊二酸的检测，原理如图1所示；其中FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶共价结合FAD作为辅因子，直接以刃天青为电子受体，不需要任何外源电子介体；所述FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶为AX-F-D2HGDH蛋白或P-D2HGDH蛋白；其中AX-F-D2HGDH蛋白的编码基因序列为SEQIDNO：1；AX-F-D2HGDH蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：2；P-D2HGDH蛋白的编码基因序列为SEQIDNO：3；P-D2HGDH蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：4。优选的，所述FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶为AX-F-D2HGDH蛋白。优选的，利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，包括以下步骤：㈠FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶的外源表达及分离纯化⑴结合序列比对分析手段，选择FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶的编码基因通过全基因合成目的基因，得到FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶目的基因；⑵将步骤⑴所得FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，其特征在于：利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶、刃天青和PBS缓冲液，实现D-2-羟基戊二酸的检测；/n所述FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶为AX-F-D2HGDH蛋白或P-D2HGDH蛋白；/n其中AX-F-D2HGDH蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO：1；/nAX-F-D2HGDH蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2；/nP-D2HGDH蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO：3；/nP-D2HGDH蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。/n

【技术特征摘要】
1.利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，其特征在于：利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶、刃天青和PBS缓冲液，实现D-2-羟基戊二酸的检测；
所述FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶为AX-F-D2HGDH蛋白或P-D2HGDH蛋白；
其中AX-F-D2HGDH蛋白的编码基因序列为SEQIDNO：1；
AX-F-D2HGDH蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：2；
P-D2HGDH蛋白的编码基因序列为SEQIDNO：3；
P-D2HGDH蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：4。


2.根据权利要求1所述的利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，其特征在于：所述FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶为AX-F-D2HGDH蛋白。


3.根据权利要求1所述的利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶和刃天青检测D-2-羟基戊二酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
㈠FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶的外源表达及分离纯化
⑴结合序列比对分析手段，选择FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶的编码基因通过全基因合成目的基因，得到FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶目的基因；
⑵将步骤⑴所得FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶目的基因连入pETDuet-1，转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，酶切验证，然后接入LB液体培养基，待OD600达到0.5-0.9时，加入1mMIPTG，22℃，180rpm诱导表达8-16小时；
⑶蛋白纯化：采用超声、高压破碎菌体，得到含有FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶目的蛋白的粗酶液；采用快速蛋白纯化仪及镍亲和柱，分离纯化蛋白，50％BufferB洗脱，超滤管浓缩得到蛋白至1-20mg/ml，然后将得到的蛋白-80℃冻存保存；
㈡利用FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶、刃天青和PBS缓冲液检测D-2-羟基戊二酸
①配制工作液：
采用pH7.4的0.067MPBS作为缓冲液，加入刃天青终浓度至0.2～10μM，加入FAD依赖型D-2-羟基戊二酸脱氢酶至终浓度为0.01～0.03mg/ml，得到工作液；
②样品准备
血清、尿液、脑脊液、细胞培养基、组织液或细胞胞内液需要经过除蛋白处理后，才可以得到待测样品；
③标准品准备
配制一系列浓度在0～50μM之间的D-2-羟基戊二酸标准品溶液；
用于检测血清、尿液或细胞培养基样品时，标准品需对应溶解在健康人的血清、尿液或新鲜的培养基中；
用于检测脑脊液、组织液或细胞胞内液样品时，标准品溶解于三蒸水中；
在用于检测去蛋白样品时，配制的标准品也需经过相同的去蛋白操作后才能使用；
④检测
将25μl标准品和待测样品，分别加入到黑色96孔板，各三个重复孔，再向其中加入75μL工作液，避光反应20-30min；使用荧光酶标仪测定荧光强度，激发波长540nm，发射波长590nm；
⑤制作标准曲线
以不含D-2-羟基戊二酸的标准品液作为对照组，计算对照组平均荧光强度；各标准品孔减去对照组平均荧光强度获得实际的荧光强度，并求得各标准品浓度的平均值，然后以D-2-HG标准品浓度为纵坐标，以平均荧光强度为横坐标，作标准曲线；
⑥样品D-2-羟基戊二酸含量计算
以不含D-2-羟基戊二酸的标准品溶液作为对照组，计算对照组平均荧光强度；各重复孔减去对照组的平均荧光强度得到实际的荧光强度，并求得重复孔的平均值，代入上述标准...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文，
申请(专利权)人：山东大学第二医院，
类型：发明
国别省市：山东;37