一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法，在脱羧酶催化脱羧反应的体系中，添加碳酸酐酶捕获脱羧反应释放的二氧化碳原位调节脱羧过程的pH。本发明专利技术的利用碳酸苷酶原位利用催化反应中释放的二氧化碳调节L‑赖氨酸脱羧酶催化合成戊二胺过程的pH，通过对两种酶的配比，所形成的混合催化剂能够有效的稳定戊二胺合成过程中的pH，L‑赖氨酸脱羧酶的催化活性提高2倍，催300g/L L‑赖氨酸溶液催化0.5h可消耗250g/L L‑赖氨酸，催化结束pH为7.7。可以看出碳酸苷酶的添加能够快速促进二氧化碳溶解，缓解反应过程中的pH剧烈变化，有效的稳定脱羧酶催化过程的pH，维持了L‑赖氨酸脱酶的活性。

【技术实现步骤摘要】
一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法
本专利技术属于化学领域，具体涉及一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法。
技术介绍
面对全球变暖得严峻挑战，可再生的生物资源代替不可再生的石油资源将继续造福人类。聚酰胺，又称尼龙，全球产量已经达到600万吨左右，需求量还在逐年增长。生物基聚酰胺研发已经成为全球关注热点。戊二胺，又称尸胺，是一种重要的工业平台化合物，可以与二元酸聚合成聚酰胺，例如PA56，PA510，PA54等，可广泛的应用于材料行业。目前，戊二胺的生产方法有两种，一种是通过基因工程菌发酵生产戊二胺，另外一种是以赖氨酸为原料，以赖氨酸脱羧酶为催化剂催化脱羧生产戊二胺。在催化L-赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸反应过程中，会释放脱去羧基释放二氧化碳，并且同时会消耗溶液中的质子。因此，在生产过程中，随着戊二胺浓度的增加，反应体系的pH值显著升高，赖氨酸脱羧酶随着pH升高，赖氨酸脱羧酶的十聚体结构会快速解聚，从而降低了酶的活性。在实际生产中，为了维持细胞的活性和稳定性，需要加入大量的强酸或缓冲盐，以控制最适pH(6.0-6.8)；然而，这样做会增加设备投资和环境负担。催化过程中，虽然伴随着酸性气体二氧化碳的释放，但是二氧化碳在溶液中的溶解度十分有限，大量二氧化碳气体被释放在空气中。在前期的研究工作中，将释放的二氧化碳通过封闭反应器加压的方式提高二氧化碳的溶解度，稳定的控制催化过程的pH，实现高效的脱羧催化过程。提高二氧化碳的溶解度是有利于脱羧的催化过程。但是该过程加压对设备要求高，且在完成催化恢复常压的过程中二氧化碳会被二次释放。因此，本专利技术旨在提供一种自调节该体系pH的方法，以有效解决上述技术问题。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法，即在脱羧酶催化脱羧反应的体系中，添加碳酸酐酶捕获脱羧反应释放的二氧化碳原位调节脱羧过程的pH。其中，所述脱羧酶包括但不限于L-赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸酸脱羧酶、精氨酸酸脱羧酶、谷氨酸酸脱羧酶和组氨酸酸脱羧酶。其中，所述L-赖氨酸脱羧酶为市场上直接购买所得，或按照如下步骤制备得到：(i)将核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的基因片段与载体pETdute-1酶切，酶切产物经回收纯化，连接，得到重组质粒pETdute-CadA；(ii)将重组质粒pETdute-CadA导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌；(iii)挑选重组菌的单克隆，培养后，收集菌液，离心，收集沉淀；(iv)将沉淀重悬于缓冲液，超声裂解，离心，收集上清液，上清液即为L-赖氨酸脱羧酶的粗酶液。步骤(i)中，所述酶切为将核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的基因片段与载体pETdute-1用限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切。步骤(i)中，所述连接为用T4DNA连接酶连接纯化的酶切产物。步骤(iii)中，所述培养为摇床过夜培养后，再加入诱导剂诱导培养。其中，所述L-赖氨酸脱羧酶的酶活为500U/mL。其中，L-赖氨酸脱羧酶的酶活定义为：每分钟消耗1μML-赖氨酸所使用的酶量定义为1U。其中，所述碳酸酐酶为市场直接购买所得，或按照如下步骤制备得到：(1)将核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的基因片段与载体pETdute-1酶切，酶切产物经回收纯化，连接，得到重组质粒pETdute-SazCA；(2)将重组质粒pETdute-SazCA导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌；(3)挑选重组菌的单克隆，培养后，收集菌液，离心，收集沉淀；(4)将沉淀重悬于缓冲液，超声裂解，离心，收集上清液，上清液即为碳酸酐酶的粗酶液。步骤(1)中，所述酶切为将核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的基因片段与载体pETdute-1用限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切。步骤(1)中，所述连接为用T4DNA连接酶连接纯化的酶切产物。步骤(3)中，所述培养为摇床过夜培养后，再加入诱导剂诱导培养。其中，所述碳酸苷酶的酶活为450U/mL。其中，L-赖氨酸脱羧酶的酶活定义为：每分钟合成1μM碳酸所使用的酶量定义为1U。其中，当所述脱羧酶为L-赖氨酸脱羧酶时，在L-赖氨酸脱羧酶催化L-赖氨酸或其盐脱羧反应制备戊二胺的体系中，添加碳酸酐酶捕获脱羧反应释放的二氧化碳原位调节脱羧过程的pH。其中，所述脱羧酶与碳酸酐酶的酶活比为1：0.5-2。优选地，所述脱羧酶与碳酸酐酶的酶活比为1：1-1.5。其中，脱羧酶用量为150-250U/g底物，优选为200U/g底物；其中，在L-赖氨酸脱羧酶催化L-赖氨酸或其盐脱羧反应制备戊二胺的体系中，所述底物为L-赖氨酸或其盐。其中，所述L-赖氨酸或其盐以溶液的形式加入，所述溶液中L-赖氨酸或其盐的浓度为150-500g/L。优选地，所述溶液中L-赖氨酸或其盐的浓度为300g/L。其中，所述反应的初始pH为5.0-6.0。优选地，所述反应的初始pH为5.5。其中，所述反应为在25-65℃，50-500rpm的转速下反应。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：本专利技术的利用碳酸苷酶原位利用催化反应中释放的二氧化碳调节L-赖氨酸脱羧酶催化合成戊二胺过程的pH，通过对两种酶的配比，在L-赖氨酸脱羧酶：碳酸苷酶酶活配比为1：0.5-2形成的混合催化剂能够有效的稳定戊二胺合成过程中的pH，L-赖氨酸脱羧酶的催化活性提高2倍，催300g/LL-赖氨酸溶液催化0.5h可消耗250g/LL-赖氨酸，催化结束pH为7.7。可以看出碳酸苷酶的添加能够快速促进二氧化碳溶解，缓解反应过程中的pH剧烈变化，有效的稳定脱羧酶催化过程的pH，维持了L-赖氨酸脱酶的活性。该方法一方面实现了脱羧过程中体系内酸的零添加，另一方面实现了脱羧过程中温室气体的真正减排。具体实施方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1：碳酸苷酶表达菌株构建、表达及粗酶液制备步骤1，合成SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；步骤2，构建重组质粒pETdute-SazCASEQIDNo.1和pETdute-1载体用同样的限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T4DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组质粒pETdute-SazCA；步骤3，将重组质粒pETdute-SazCA导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒pETdute-SazCA的大肠杆菌BL21(DE3)，命名为重组菌1；步骤4，挑选重组菌1的单克隆，摇床37℃，200rpm培养4h后，加入诱导剂IPTG终浓度0.8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法，其特征在于，在脱羧酶催化脱羧反应的体系中，添加碳酸酐酶捕获脱羧反应释放的二氧化碳原位调节脱羧过程的pH。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法，其特征在于，在脱羧酶催化脱羧反应的体系中，添加碳酸酐酶捕获脱羧反应释放的二氧化碳原位调节脱羧过程的pH。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱羧酶为L-赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸酸脱羧酶、精氨酸酸脱羧酶、谷氨酸酸脱羧酶和组氨酸酸脱羧酶中的任意一种。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳酸酐酶按照如下步骤制备得到：
(1)将核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的基因片段与载体pETdute-1酶切后连接，得到重组质粒pETdute-SazCA；
(2)将重组质粒pETdute-SazCA导入大肠杆菌中，得到重组菌；
(3)将重组菌培养后，收集菌液，离心，收集沉淀；
(4)将沉淀重悬于缓冲液，超声，离心，收集上清液，即为碳酸酐酶的粗酶液。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，许晟，王昕，欧阳平凯，刘福建，陈昌主，谭伟民，马仁，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32