一种用于同一个单细胞分泌蛋白、细胞质mRNA和核内DNA的同步检测芯片及方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，涉及单细胞的分泌蛋白、细胞质mRNA和核内DNA的检测芯片及方法。一种用于同一个单细胞分泌蛋白、细胞质mRNA和核内DNA的同步检测芯片，该芯片包括阀门控制层、检测层和基底；所述的阀门控制层设置在所述检测层的上方，基底设置在检测层的下方，所述的检测层包括若干个单细胞检测单元、总进样口、进样微流道、出样微流道和总出样口，所述总进样口与进样微流道连接，总出样口与出样微流道连接，每个单细胞检测单元分别与进样微流道和出样微流道连接。本发明专利技术的有益效果是：每个检测单元可以进行同一个单个细胞细胞核gDNA、细胞质内mRNA和细胞分泌蛋白的多重信息获取与检测；每个芯片可以同时进行多个单细胞操作，而且试剂消耗量少，成本低，准确度高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于同一个单细胞分泌蛋白、细胞质mRNA和核内DNA的同步检测芯片及方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及同一个单细胞的分泌蛋白、细胞质mRNA和核内DNA的检测芯片及方法。
技术介绍
近年来众多研究表明细胞具有显著的差异性，无论在正常组织还是病变组织中，即使相同类别的细胞，它们在基因表达、遗传基因或分泌蛋白上都具有异质性。因此单细胞水平的生物信息是精准医疗的重要基础。精准医疗是现代医学发展的最重要的方向。提倡的“精准医疗包括精准诊断和精准治疗。精准诊断不仅需要全面的基因信息，而且需要多层面的生物信息，包括基因表型、基因表达、蛋白类物质（抗体、抗原、糖类等）、外泌体等方面的信息。这些物质在重大疾病发生发展过程中都呈现出疾病相关的差异性，多层面信息的综合分析临床精准诊断治疗具有不可预估的意义。目前发展基因测序技术发展较快，可以在单细胞水平进行基因测序，蛋白类物质检测也有多种手段，外泌体的检测相对比较薄弱。而且，这些多个层面的信息很难在单细胞或少量细胞水平上获取。高质量单细胞测序的瓶颈在于单细胞全基因组基因获取的质量。在重大疾病，比如肿瘤中，变异的组织细胞具有很强的异质性，肿瘤组织中真正在病情重发挥重要作用的可能就是很少量的某些细胞，所以单细胞水平的生物信息具有非常重要的意义。随着测序技术的快速发展，基因测序技术本身已经很成熟。然而对少量细胞或单细胞的基因进行测序，要得到高质量的测序结果，主要的瓶颈在于测序之前如何获得高质量的单细胞基因。在提取单细胞或少量细胞的基因过程中，传统操作过程造成基因污染和丢失严重。每个单细胞中的基因拷贝数有限，如果丢失了，即便有再高端的测序技术，也无法获得真实的基因信息。更重要的是，目前还没有能够同时检测同一个单细胞全基因组gDNA/mRNA和多种分泌蛋白这三个层次信息的工具和方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够同时对同一个单细胞进行全基因组gDNA/mRNA和多种分泌蛋白三个层次的检测芯片和方法。为了实现上述目的，本专利技术首先采用的技术方案是提供一种用于同一个单细胞分泌蛋白、细胞质mRNA和核内DNA的同步检测芯片，该芯片包括阀门控制层、检测层和基底；所述的阀门控制层设置在所述检测层的上方，基底设置在检测层的下方；所述的检测层包括多个单细胞检测单元、总进样口、进样微流道、出样微流道和总出样口，所述总进样口与进样微流道连接，总出样口与出样微流道连接，每个单细胞检测单元分别与进样微流道和出样微流道连接。作为本专利技术的一种优选方式，所述的单细胞检测单元包括样品入口、微流道、cDNA扩增腔、gDNA扩增腔和分泌蛋白检测腔，所述微流道设有：第一支路，所述第一支路连接cDNA扩增腔；第二支路，所述第二支路连接gDNA扩增腔；第三支路，所述第三支路连接分泌蛋白检测腔；分泌蛋白检测腔的后端与出样微流道连接；所述第一支路、第三支路的前端均与第二支路的前端连通；所述基底上，与所述分泌蛋白检测腔对应的位置设有捕获抗体阵列条形码。作为本专利技术的一种优选方式，所述的阀门控制层包括多个控制单元，每一个控制单元包括：总控阀门；所述第一支路上，设置在所述cDNA扩增腔前方的第一入口阀门和其后方的第一出口阀门；所述第二支路上，设置在所述gDNA扩增腔前方的第二入口阀门和其后方的第二出口阀门；所述第三支路上，设置在所述分泌蛋白检测腔前方的第三入口阀门；所述总控阀门与所述第二入口阀门、及二者之间的微流道组成单细胞捕获腔。进一步优选地，所述第一支路通过旁路与所述第二支路前端连通，所述旁路上设有阀门。进一步优选地，所述的第一入口阀门和cDNA扩增腔之间设有至少一个中间阀门，所述第一入口阀门与中间阀门之间形成至少一个反应腔。进一步优选地，所述的第二入口阀门和gDNA扩增腔之间设有至少一个中间阀门；所述第二入口阀门和中间阀门之间形成至少一个反应腔。本专利技术提供的上述检测芯片通过以下方法制备：首先按照芯片设计图进行掩模版制备，然后通过光刻把图案转移到硅片上，之后把硅片作为母版利用注模的方式浇注硅胶，通过烘烤使硅胶固化并从硅片上揭下，把检测层和阀门控制层对准后进行键合组成硅胶芯片，然后硅胶芯片再与设有捕获抗体阵列条形码的基底键合。本专利技术还提供了采用上述检测芯片进行同一个单细胞分泌蛋白、细胞质mRNA和核内DNA的同步检测方法，包括：将细胞悬液注入总进样口，在单细胞捕获腔捕获单个细胞，进行培养，在培养过程中细胞分泌的蛋白进入分泌蛋白检测腔中，被捕获抗体阵列条形码特异性捕获；培养一段时间后，加入细胞膜裂解液裂解细胞膜，将释放出的细胞质冲入第一支路中，在第一支路中依次进行mRNA的反转录、二链生成反应、环化反应；将环化反应后的液体冲入cDNA扩增腔，并加载基因扩增试剂，进行cDNA扩增；加入细胞核裂解液，细胞核裂解释放gDNA；在第二支路中依次进行变性反应、中和反应；将中和后的溶液冲入gDNA扩增腔，并加载基因扩增试剂，进行gDNA扩增反应；扩增的cDNA和gDNA产物收集后揭掉检测芯片，在基底上加载荧光标记的检测抗体，检测抗体与细胞分泌蛋白特异性结合，然后对基底进行冲洗，用氮气吹干后检测荧光信号。作为本专利技术的一种优选方式，所述mRNA的反转录反应、二链生成反应、环化反应分别在不同的反应腔中进行。进一步优选地，所述的变性反应、中和反应分别在不同的反应腔中进行。本专利技术与现有技术相比，具有的有益效果是：1、每个检测单元可以进行单个细胞细胞核gDNA、细胞质内mRNA和细胞分泌蛋白的多重信息获取与检测；2、每个芯片可以同时进行多个单细胞操作，而且试剂消耗量少，成本低；3、本专利技术的芯片通过阀门与微流道配合形成不同的反应腔，不同反应在不同的反应腔内进行，根据反应腔的容积可精确控制液体体积，减少人为误差，提高检测准确度。附图说明图1是本专利技术实施例中提供的检测芯片的整体结构图；图2是图1中其中一个检测单元的结构示意图；图3是本专利技术实施提供的检测方法中单细胞捕获、细胞膜裂解、细胞质释放、细胞核裂解的示意图；图4是本专利技术实施提供的检测方法中单细胞分泌蛋白检测的荧光信号；图5是本专利技术实施提供的检测方法中扩增的cDNA和gDNA电泳结果；图6是本专利技术实施提供的检测方法中扩增的cDNA和gDNA产物不同基因位点的PCR电泳结果。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面结合附图和具体实施例，对本专利技术进行更详细的说明。附图中给出了本专利技术的较佳的实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。本专利技术提供的第一个实施例是一种用于同一个单细胞分泌蛋白、细胞质mRNA和核内DNA的同步检测芯片，本实施例的检测芯片，从上到下依次包括阀门控制层、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于同一个单细胞分泌蛋白、细胞质mRNA和核内DNA的同步检测芯片，该芯片包括阀门控制层、检测层和基底；所述的阀门控制层设置在所述检测层的上方，基底设置在检测层的下方，其特征在于：所述的检测层包括多个单细胞检测单元、总进样口、进样微流道、出样微流道和总出样口，所述总进样口与进样微流道连接，总出样口与出样微流道连接，每个单细胞检测单元分别与进样微流道和出样微流道连接。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于同一个单细胞分泌蛋白、细胞质mRNA和核内DNA的同步检测芯片，该芯片包括阀门控制层、检测层和基底；所述的阀门控制层设置在所述检测层的上方，基底设置在检测层的下方，其特征在于：所述的检测层包括多个单细胞检测单元、总进样口、进样微流道、出样微流道和总出样口，所述总进样口与进样微流道连接，总出样口与出样微流道连接，每个单细胞检测单元分别与进样微流道和出样微流道连接。


2.根据权利要求1所述的用于同一个单细胞分泌蛋白、细胞质mRNA和核内DNA的同步检测芯片，其特征在于：所述的单细胞检测单元包括样品入口、微流道、cDNA扩增腔、gDNA扩增腔和分泌蛋白检测腔，所述微流道设有：
第一支路，所述第一支路连接cDNA扩增腔；
第二支路，所述第二支路连接gDNA扩增腔；
第三支路，所述第三支路连接分泌蛋白检测腔，分泌蛋白检测腔的后端与出样微流道连接；
所述第一支路、第三支路的前端均与第二支路的前端连通；
所述基底上，与所述分泌蛋白检测腔对应的位置设有捕获抗体阵列条形码。


3.根据权利要求2所述的用于同一个单细胞分泌蛋白、细胞质mRNA和核内DNA的同步检测芯片，其特征在于：所述的阀门控制层包括多个控制单元，每一个控制单元包括：总控阀门；
所述第一支路上，设置在所述cDNA扩增腔前方的第一入口阀门和其后方的第一出口阀门；
所述第二支路上，设置在所述gDNA扩增腔前方的第二入口阀门和其后方的第二出口阀门；
所述第三支路上，设置在所述分泌蛋白检测腔前方的第三入口阀门；
所述总控阀门与所述第二入口阀门、及二者之间的微流道组成单细胞捕获腔。


4.根据权利要求3所述的用于同一个单细胞分泌蛋白、细胞质mRNA和核内DNA的同步检测芯片，其特征在于：所述第一支路通过旁路与所述第二支路前端连通，所述旁路上设有阀门。


5.根据权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩琳，张宇，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37