一种棉花下胚轴单细胞的分离方法技术

本发明专利技术涉及分子生物技术领域，且公开了一种棉花下胚轴单细胞的分离方法。该棉花下胚轴单细胞的分离方法，基于棉花叶片、愈伤组织、根的原生质体分离技术，对酶促体系进行优化改进，构建了适用于棉花下胚轴单细胞分离的实验体系，利用该方法可得到高质量，数量多的下胚轴单细胞，愈伤组织原生质体酶解方法中，酶解后的原生质体用W5solution重悬，本发明专利技术中用PBS+0.04％BSA进行重悬，效果较好，酶解时间只需4‑6小时，两次离心之后过40μm过滤筛，可以得到分散完整的下胚轴单细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种棉花下胚轴单细胞的分离方法
本专利技术涉及分子生物
，具体为一种棉花下胚轴单细胞的分离方法。
技术介绍
植物的原生质体系统是现代植物生物学中强大的工具，在植物分子生物技术中有广泛的应用，可用于瞬时表达，亚细胞定位，融合杂交，荧光活细胞分选，植物育种等，去掉植物细胞壁获得原生质体有两种方法，机械的人工操作和酶解法，较早利用机械法制备原生质体，如将组织切片置于低渗状态从而细胞壁收缩(质壁分离)，这种方法操作困难，产量低，现在很少使用，目前应用最多的是酶解法，并不是所有的植物材料都能通过酶解法得到原生质体。原生质体的成功分离受到物种类型、源材料、酶组合配比等因素的影响。原生质体分离的最常见来源是叶片组织，目前已从烟草，拟南芥，水稻和其他非典范植物物种苜蓿，百日草，杜鹃花，巴西橡胶树，木薯，菜豆，木兰中成功分离出植物叶肉原生质体；一些观赏植物，如蔷薇果则是从花瓣中分离原生质体，玉米胚乳也可用于原生质体分离。另外，通过改变酶促条件，优化配比，在单子叶植物兰花花瓣和芽中成功分离了高产可用的原生质体。目前，棉花原生质体主要从叶片，根，愈伤组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种棉花下胚轴单细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)制备母液：将1.95g的固体MES溶于80ml的ddH2O中，用KOH调PH至5.7，再定容至100ml；/n2)制备酶解液：首先称量纤维素酶(0.15g)、半纤维素酶(0.1g)、离析酶(0.75g)，加入5ml甘露醇，0.2ml的KCL，2ml的MES，稍微混匀后放入55℃水浴锅加热10min，冷却至室温，再依次加入100μl的CaCl2，0.01gBSA，少量的ddH2O，此时酶解液是淡褐色，澄清溶液，然后用0.22μm孔径的滤膜过滤到无菌容器中备用；/n3)下胚轴取样：将剥好的棉花种子(品种为Jin668，专利申请号...

【技术特征摘要】
1.一种棉花下胚轴单细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备母液：将1.95g的固体MES溶于80ml的ddH2O中，用KOH调PH至5.7，再定容至100ml；
2)制备酶解液：首先称量纤维素酶(0.15g)、半纤维素酶(0.1g)、离析酶(0.75g)，加入5ml甘露醇，0.2ml的KCL，2ml的MES，稍微混匀后放入55℃水浴锅加热10min，冷却至室温，再依次加入100μl的CaCl2，0.01gBSA，少量的ddH2O，此时酶解液是淡褐色，澄清溶液，然后用0.22μm孔径的滤膜过滤到无菌容器中备用；
3)下胚轴取样：将剥好的棉花种子(品种为Jin668，专利申请号201510833618.0)用50％次氯酸钠杀菌，无菌水清洗数次后放入无菌苗培养基中，28℃暗培养1天，挑去种皮，将苗扶正，在28℃，暗培养4-5d，结束后将无菌苗切掉根部和顶端，再用锋利的解剖刀，避免拉扯地将剩下的下胚轴均匀切割成1-2mm的小段，所用的无菌苗培养基组分及配比：无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，15...

【专利技术属性】
技术研发人员：金双侠，张献龙，朱相潜，覃元，许忠平，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42