一种快速高效的香茅原生质体制备方法技术

本发明专利技术公开了一种快速高效的香茅原生质体制备方法，属于植物细胞工程领域。采用健康生长的香茅组培苗为实验材料，使用CPW溶液配制酶解液，采用低速震荡酶解法对香茅叶片进行酶解消化，高效的制备原生质体。最后利用蔗糖密度梯度离心法纯化收集高质量的香茅原生质体。本发明专利技术简单方便，易于操作，且分离得到的原生质体产量高，细胞完整，呈球形，富含叶绿体，具有较高活力。本发明专利技术为利用香茅叶片瞬时转化体系进行基因功能鉴定、亚细胞定位、蛋白质互作以及香茅细胞融合、单细胞测序等方面的研究应用提供重要基础。

【技术实现步骤摘要】
一种快速高效的香茅原生质体制备方法
本专利技术属于植物细胞工程领域，涉及一种快速高效的香茅原生质体制备方法。
技术介绍
香茅(Cymbopogoncitratus)，是香茅属多年生具有芳香气味的草本植物，原产于热带地区，如印度、斯里兰卡等，在我国的广东、海南、云南等地广泛分布。古书记载香茅草性味甘、辛、性温,有疏风通络,温中止痛、醒脑、止泻的功效。香茅用作茶饮具有一定的保健作用，其药理作用主要为抗菌、抗炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤、抗焦虑、降压、降血糖等。其茎叶提取的精油在食物、防腐、医药等领域有着广泛的应用。原生质体指细胞通过质壁分离，能够和细胞壁分开的那部分细胞物质，包括细胞膜、细胞质和细胞核，换言之原生质体就是除去细胞壁的被细胞膜包围的“裸露细胞”。植物原生质体由于失去了细胞壁的包被，更易接受外源DNA等物质，是进行基因功能鉴定、亚细胞定位、蛋白质互作等方面的研究的理想材料。另外原生质体融合技术对于培育新品种同样有着重要意义。目前对香茅的研究主要集中在有效化学成分的提取、分离及活性研究上。未发现关于香茅原生质体制备的研究报道，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种香茅原生质体的制备方法，其特征在于，采用香茅组培幼苗为材料，利用CPW溶液配制酶解液，采用低速震荡酶解法对香茅叶片进行酶解消化，制备原生质体；通过蔗糖密度梯度离心法来纯化收集香茅原生质体。/n

【技术特征摘要】
1.一种香茅原生质体的制备方法，其特征在于，采用香茅组培幼苗为材料，利用CPW溶液配制酶解液，采用低速震荡酶解法对香茅叶片进行酶解消化，制备原生质体；通过蔗糖密度梯度离心法来纯化收集香茅原生质体。


2.根据权利要求1所述的香茅原生质体的制备方法，其特征在于，以组织培养的香茅幼嫩叶片为材料，利用纤维素酶和离析酶酶解去除细胞壁，通过蔗糖密度梯度离心获得健康完整的香茅叶肉原生质体。


3.根据权利要求1所述的香茅原生质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、香茅组培苗培养：剪取香茅的健壮的幼茎，消毒后移至1/2MS培养基培养；
S2、原生质体酶解：选取步骤S1中生长状态良好的组培幼苗，弃叶片下部及顶部，切成条状，放入酶解液中；25℃-30℃避光条件下，50-60rpm低速震荡酶解3-4h，最后70-80rpm振荡5-10分钟；
S3、原生质体分离：吸取步骤S2所得酶解混合液，过滤，滤液离心；
S4、蔗糖密度梯度离心法纯化：将步骤S3所得离心产物弃上清，用W5溶液重悬原生质体沉淀，然后在滤液下层注入含10％-20％的蔗糖的CPW溶液，避免震荡混溶，离心，在两液相之间出现一条绿色带，即纯净的原生质体；
S5、原生质体收集：吸取中间层的原生质体，加入W5溶液，离心，弃上清，加入MMG溶液悬浮沉淀。


4.根据权利要求3所述的香茅原生质体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述消毒的具体方法为：先用无菌水浸泡后流水冲洗，然后在超净台中用医用酒精浸泡5-10min，无菌水冲洗2-3次，再用次氯酸钠溶液浸泡5-10min，最后用无菌水冲洗3-7次。


5.根据权利要求3所述的香茅原生质体的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述的酶解液的配方如...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹建美，储昭庆，张凯，蒋敏，宋昌梅，
申请(专利权)人：上海辰山植物园，
类型：发明
国别省市：上海;31