一种积雪草干细胞的培养方法及其在冻干粉制备中的应用技术

一种积雪草干细胞的培养方法，是将积雪草茎横切为3~5mm外植体，进行消毒处理，然后在0.6~0.8mol/L蔗糖溶液中浸泡8~12h，然后接种于缓释培养基上进行培养；所述缓释培养基是以MS培养基作为基础培养基，其中补充了6‑BA、IAA、茉莉酸甲酯（MJ）、环糊精复合生长素，所述环糊精复合生长素是由环糊精包覆Cu

【技术实现步骤摘要】
一种积雪草干细胞的培养方法及其在冻干粉制备中的应用
本专利技术涉及干细胞
，具体涉及一种积雪草干细胞的培养方法及其在冻干粉制备中的应用。
技术介绍
皮肤衰老分为内源性衰老和外源性老化。人体每天需要更新10％的胶原蛋白，随着年龄增长，成纤维细胞合成胶原蛋白的能力下降，人体胶原蛋白的合成速度逐渐低于代谢速度，人体就会缺乏胶原蛋白，常包括皮肤在内的各种组织器官都会逐渐衰老，此为内源性衰老；外界因素如紫外光照射、化妆品使用不当、物理性损伤等导致皮肤内部自由基增多，破坏胶原蛋白使其崩解、断裂，从而交联异常，同时成纤维细胞合成胶原蛋白受阻，进一步引起皮肤老化、破坏皮肤屏障功能，造成皮肤的外源性老化。植物干细胞又称为分生组织，是相对于植物体内已经分化成熟的成熟组织而言的为分化的细胞。植物分生组织根据其位置可以分为顶端分生组织和侧生分生组织两大类。其中顶端分生组织包括茎尖分生组织和根尖分生组织，侧生分生组织包括维管形成层和木栓形成层。研究发现，植物干细胞在修复肌肤、延缓衰老方面有着超群的功效。积雪草植物中的活性成分具有抗衰老、提高免疫力及保护心脑血管等的作用，积雪草中含有积雪草苷、积雪草酸、羟基积雪草苷和羟基积雪草酸等对皮肤具有优异护理效果的有效成分，其中积雪草苷具有提高成纤维细胞DNA合成，促进成纤维细胞增殖、合成胶原蛋白的作用，被用于抗衰老护肤品中。但其质量受环境因素和收获条件的影响，活性物质产量低，有些植物的活性成分仅限于特定的组织部位或生长阶段合成。对于结构复杂、人工合成困难的活性成分，传统的愈伤组织培养方式虽然可以在短时间内生产有价值的产品，节约了资源，但是经历脱分化的愈伤组织液泡化程度高，常常增加了细胞的异质性，对振荡培养的剪切力敏感，经多次有丝分裂后，容易产生DNA甲基化以及转座子被激活等变异现象，导致培养过程不稳定，天然产物的产量、性质不稳定等缺点，难以适应现代工业生产需求，作为草本双子叶植物的积雪草中具有微弱的侧生分生组织，因而可以提取到具有形成层的组织，因此干细胞培养过程中需要抑制细胞分化，使得干细胞达到值增殖不分化，同时增加有效活性成分含量是培养的关键。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种富含积雪草苷的积雪草干细胞的培养方法。本专利技术另一目的是提供上述积雪草干细胞冻干粉的制备方法。本专利技术目的通过如下技术方案实现：一种积雪草干细胞的培养方法，其特征在于：将积雪草茎横切为3～5mm外植体，进行消毒，然后在0.6～0.8mol/L的蔗糖水溶液中浸泡8～12h、使得对于渗透压敏感的非形成层组织坏死，对于渗透压不敏感的干细胞保持活性，然后接种于缓释培养基上进行培养；上述缓释培养基是以MS培养基作为基础培养基，其中补充了0.5～1mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、0.25～0.35mg/LIAA(3-吲哚乙酸)、0.2～0.4mg/LMJ(茉莉酸甲酯)、3～3.8mg/L环糊精复合生长素，所述环糊精复合生长素是由环糊精包覆Cu2+和2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)的复合物、使得Cu2+和2,4-D在培养基中形成缓释。培养基中过高浓度的Cu2+会增强细胞分裂素氧化酶的活性，抑制6-BA的活性，使得6-BA的作用无法发挥；本专利技术以环糊精作为缓释载体，在培养基中对2,4-D和Cu2+进行缓慢释放，培养初期，6-BA不受较低浓度的Cu2+抑制，6-BA与较低浓度的IAA协同有效发挥其诱导作用，促进细胞快速分裂，随着Cu2+缓释增加至一定浓度时，抑制了培养基中细胞分裂素6-BA的活性、消除了细胞分裂素和细胞生长素协同诱导作用从而抑制其诱导的后续分化，而2,4-D浓度逐渐增加，提高了培养基中的生长素的浓度，从而达到促进干细胞增殖同时抑制细胞分化的效果。MJ、Cu2+对于积雪草苷含量的提高均具有诱导作用，本专利技术以MJ和Cu2+作为诱导子同时也提高了积雪草干细胞中积雪草苷的含量。进一步，上述环糊精复合生长素是在环糊精溶液中加入硫酸铜溶液和氨水，然后依次加入生长素2,4-D、PVP，搅拌升温至80～90℃，保温20～30min，过滤晾干后得到环糊精包覆的Cu2+和2,4-D的复合生长素。进一步，上述环糊精溶液浓度为50g/L，硫酸铜溶液浓度为0.1～0.2mol/L、氨水浓度质量浓度为25～28％。进一步，上述环糊精、生长素2,4-D、硫酸铜和PVP的质量比为：3～3.8：0.5～0.8:0.06～0.08：0.06～0.1。本专利技术中以环糊精作为Cu2+和生长素2,4-D的缓释载体，具体是通过环糊精与Cu2+之间的络合作用将大量Cu2+固定在载体上，再通过氨水的络合作用，将未固定的Cu2+络合，氨水与Cu2+的络合物、以及生长素2,4-D通过PVP的分散作用，被有效包合在环糊精内部，在培养基中形成缓慢缓释。通过Cu2+和2,4-D浓度的变化，抑制了细胞分化，并将培养基中的营养成分充分应用到增殖过程，使得培养基更适合干细胞的继代培养，不用重新配置新的继代培养基，简化了培养步骤，缩短了培养周期，培养过程中，缓释体中的PVP还起到了抗褐化的作用。上述环糊精优选β-环糊精。进一步，上述消毒处理是采用体积浓度为70％的乙醇浸润积雪草含有形成层的外植体30～40s，然后采用无菌水洗涤，再重复相同的乙醇浸润一次，无菌水洗涤后置于50℃下加热3～4min。由于积雪草的茎较细，采用常规的酒精浸润后，再采用升汞或者抗生素浸泡，虽然能达到很好的灭菌的效果，但是，同时也伴随着干细胞诱导过程中容易出现褐化的问题。因此，本专利技术将积雪草外植体控制为3～5mm，采用乙醇重复浸润2次以及结合较高温度处理，达到优异的灭菌效果，同时也降低了发生褐化的几率。进一步，在接种之前，将蔗糖浸泡后的外植体在4～6℃下处理24h，抑制培养过程中组织发生分化。本专利技术采用蔗糖浸泡后再低温处理，通过蔗糖作为渗透剂浸泡，使得对于渗透压敏感的非形成层组织坏死，而对于渗透压不敏感的干细胞保持活性，再经过较低温度处理后，降低诱导培养过程中干细胞分化的几率，使得干细胞只增殖不分化。最具体的，一种积雪草干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，按如下步骤进行：S1、消毒处理：取积雪草切取茎部为3～5mm，采用体积浓度为70％的乙醇浸润30～40s，然后采用无菌水洗涤，再重复相同的乙醇浸润一次，无菌水洗涤后置于50℃下加热3～4min；S2、渗透处理：将消毒处理后的外植体在0.8mol/L蔗糖溶液中浸泡8～12h，然后在4～6℃下处理24h；S3、(1)环糊精复合生长素制备：在50g/L的环糊精溶液中加入0.1～0.2mmol/L的硫酸铜溶液和过量的质量浓度为25～28％的氨水，然后依次加入生长素2,4-D、PVP，搅拌升温至80～90℃，保温20～30min，过滤晾干后得到环糊精包覆的Cu2+和2,4-D的复合生长素，环糊精、生长素2,4-D、硫酸铜和PVP质量比为3～3.8：0.5～0.8:0.06～0.08：0.06～0.1；(2)干细胞培养：将步骤S2处本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种积雪草干细胞的培养方法，其特征在于：是将积雪草茎横切为3~5mm外植体，进行消毒，然后在0.6~0.8mol/L的蔗糖水溶液中浸泡8~12h，然后接种于缓释培养基上进行培养；所述缓释培养基是以MS培养基作为基础培养基，其中补充了0.5~1mg/L 6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、0.15~0.25mg/L IAA（3-吲哚乙酸）、0.2~0.4mg/L MJ（茉莉酸甲酯）、3~3.8mg/L环糊精复合生长素，所述环糊精复合生长素是由环糊精包覆Cu

【技术特征摘要】
1.一种积雪草干细胞的培养方法，其特征在于：是将积雪草茎横切为3~5mm外植体，进行消毒，然后在0.6~0.8mol/L的蔗糖水溶液中浸泡8~12h，然后接种于缓释培养基上进行培养；所述缓释培养基是以MS培养基作为基础培养基，其中补充了0.5~1mg/L6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、0.15~0.25mg/LIAA（3-吲哚乙酸）、0.2~0.4mg/LMJ（茉莉酸甲酯）、3~3.8mg/L环糊精复合生长素，所述环糊精复合生长素是由环糊精包覆Cu2+和2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）的复合物。


2.如权利要求1所述的一种积雪草干细胞的培养方法，其特征在于：所述环糊精复合生长素是在环糊精溶液中加入硫酸铜溶液和氨水，然后依次加入生长素2,4-D、PVP，搅拌升温至80~90℃，保温20~30min，过滤晾干后得到环糊精包覆的Cu2+和2,4-D的复合生长素。


3.如权利要求1或2所述的一种积雪草干细胞的培养方法，其特征在于：所述环糊精、生长素2,4-D、硫酸铜和PVP的质量比为：3~3.8：0.05~0.8:0.06~0.08：0.06~0.1。


4.如权利要求1-3任一项所述的一种积雪草干细胞的培养方法，其特征在于：所述消毒处理是采用体积浓度为70%的乙醇浸润积雪草含有形成层的外植体30~40s，然后采用无菌水洗涤，再重复相同的乙醇浸润一次，无菌水洗涤后置于50℃下加热3~4min...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓菊，
申请(专利权)人：李晓菊，
类型：发明
国别省市：甘肃;62