靶向CD123的嵌合抗原受体及含有靶向CD123嵌合抗原受体的双靶点嵌合抗原受体制造技术

本发明专利技术公开了编码靶向CD123的嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其编码的所述胞外区包含CD123结合结构域，所述CD123结合结构域为抗CD123的单链抗体可变区片段；所述抗CD123的单链抗体可变区片段为SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列、SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列，或SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列。本发明专利技术嵌合抗原受体可用于CD123

【技术实现步骤摘要】
靶向CD123的嵌合抗原受体及含有靶向CD123嵌合抗原受体的双靶点嵌合抗原受体
本专利技术涉及生物医药
，特别涉及靶向CD123的嵌合抗原受体及含有靶向CD123嵌合抗原受体的双靶点嵌合抗原受体。
技术介绍
嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,CAR)修饰的T细胞作为一种免疫治疗策略，在肿瘤治疗中受到广泛的重视和应用。CAR的结构一般由胞外靶向连接区(常为具有抗原识别功能的单链抗体)，铰链区，跨膜区和胞内信号转导区四部分组成。目前根据胞内信号转导区加入共刺激分子的数量，将CAR分为一代(无共刺激分子)、二代(含一种共刺激分子)和三代(含两种共刺激分子)。目前应用最多的是二代CAR。急性髓系白血病(AML)是髓系造血干祖细胞失控性扩增为特征的异质性肿瘤，是最常见的成人白血病，占白血病相关死亡人数的第一位。尽管化疗和造血干细胞移植对AML的治疗有一定效果，但多中心回顾性研究显示，60岁以下AML患者仅40％能够生存5年以上，复发患者和60岁以上患者预后更差。造血干细胞移植为难治复发AML患者治愈的唯一方式，但至少有一半的难治复发患者不适合做移植术，且难治复发AML患者移植后复发率和移植相关死亡率很高，因此需要更好的治疗方式改善AML预后。CD123是AML相关抗原，高表达CD123是AML预后不良因素之一。CD123高表达于白血病干细胞，低表达或不表达于正常造血干细胞，成为治疗AML的理想治疗靶点。除了AML以外，CD123还会过表达于其他血液系统肿瘤，如急性B淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、浆细胞样树突细胞肿瘤和多毛细胞白血病等。此外，CD33也在大量AML疾病中的特异性表达以及在正常细胞的最低限度表达，因此它也一直是AML治疗的重要靶点。一项针对319例AML患者的研究发现95.7％的AML患者表达CD33或CD123中的一种或两种抗原，因此，同时靶向CD33和CD123可用于治疗大部分患者的AML，同时可以防止与复发相关的抗原逃逸，更好的提高AML的治疗效果。由于市场上单一针对CD123或CD33的嵌合抗原受体治疗白血病过程中容易因白血病细胞的逃避机制导致复发和无效，因此需要寻找一种更加有效的嵌合抗原受体解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术是针对现有技术中CD123的嵌合抗原受治疗白血病的疗效差，容易复发和无效的缺点，提供了一种靶向CD123的嵌合抗原受体及其应用。本专利技术的一个方面，是提供了编码靶向CD123的嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其编码的所述胞外区包含CD123结合结构域，所述CD123结合结构域为抗CD123的单链抗体可变区片段；所述抗CD123的单链抗体可变区片段为SEQIDNO.13所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列、SEQIDNO.14所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列，或SEQIDNO.15所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列。在本专利技术中，CD123+肿瘤细胞与SEQIDNO.1所示的6E11-123CAR、SEQIDNO.2所示的12H7-123CAR、SEQIDNO.3所示的13C3-123CAR结合后可以激活相应的CAR-T细胞，产生细胞毒效应；而CD123-细胞不能激活CAR-T细胞产生应答。因此，以6E11-CD123scFv(SEQIDNO.13所示)、12H7-CD123scFv(SEQIDNO.14所示)、13C3-CD123scFv(SEQIDNO.15所示)为抗原识别区制备的CAR-T细胞在识别并杀伤CD123+肿瘤细胞的同时，对CD123-细胞不产生脱靶效应。在本专利技术中，CD123+和/或CD33+肿瘤细胞均可与SEQIDNO.6所示的CD123/CD33双靶点嵌合抗原受体结合并激活CAR-T细胞，产生细胞毒效应；而CD123和CD33都不表达的细胞不能激活CAR-T细胞产生应答。因此，CD123和CD33双靶点嵌合抗原受体T细胞可识别并杀伤CD123+和/或CD33+肿瘤细胞，同时对CD123-CD33-细胞不产生脱靶效应。在本专利技术中，可以对所述CD123scFv的氨基酸序列以合适的方式进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的亲和力和/或解离性质，而这些突变后的氨基酸序列均包含在本专利技术的保护范围之内。在本专利技术中，所述核酸分子可编码信号肽。信号肽可引导抗原识别区及铰链区转移到胞外。任意合适的信号肽或信号肽的组合均可实现本专利技术的目的。作为优选，在本专利技术的一个实施方式中，本专利技术核酸分子编码的所述胞外区还包含构建在所述的嵌合抗原受体氨基末端的信号肽或与所述信号肽具有90-99％同一性的氨基酸序列，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列或GM-CSF。更优选地，所述信号肽为如SEQIDNO.17所示的信号肽。由图2-5可以看出，在本专利技术的一个实施方式中，所述信号肽(或引导肽，CD8αleader)构建在CD123结合结构域的氨基末端。在本专利技术的一个实施方式中，本专利技术核酸分子编码的所述CD123结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接。任意合适的铰链区序列均可实现本专利技术的目的。作为优选，在本专利技术的一个实施方式中，所述铰链区为CD8α中的铰链区序列。在本专利技术中，所述核酸分子还编码跨膜结构域。任意合适的跨膜结构域均能实现本专利技术的目的。作为优选，在本专利技术的一个实施方式中，所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD123、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。作为优选，在本专利技术的一个实施方式中，所述跨膜区为CD8α跨膜结构域或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。在本专利技术中，所述核酸分子编码的所述胞内信号转导区还包含共刺激因子。作为优选，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHCI类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.编码靶向CD123的嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其特征在于，其编码的所述胞外区包含CD123结合结构域，所述CD123结合结构域为抗CD123的单链抗体可变区片段；/n所述抗CD123的单链抗体可变区片段为SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列、SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列，或SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列。/n

【技术特征摘要】
1.编码靶向CD123的嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其特征在于，其编码的所述胞外区包含CD123结合结构域，所述CD123结合结构域为抗CD123的单链抗体可变区片段；
所述抗CD123的单链抗体可变区片段为SEQIDNO.13所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列、SEQIDNO.14所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列，或SEQIDNO.15所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列。


2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述胞外区还包含构建在所述的嵌合抗原受体氨基末端的信号肽或与所述信号肽具有90-99％同一性的氨基酸序列，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列或GM-CSF，优选为如SEQIDNO.17所示的信号肽。


3.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述CD123结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接，所述铰链区优选为CD8α中的铰链区序列；所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD123、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4-1BB或CD154。


4.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述胞内信号转导区还包含共刺激因子。


5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHCI类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD1236、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD1239、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76。


6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为CD28或4-1BB或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列，优选为4-1BB或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。


7.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8或SEQIDNO.9所示。


8.靶向CD123的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由权利要求1～7中任意一项所述的核酸分子编码。


9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。


10.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求1～7中任意一项所述的核酸分子。


11.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含如权利要求1～7中任意一项所述的核酸分子、如权利要求8或9所述的嵌合抗原受体或如权利要求10所述的载体。


12.如权利要求1～7中任意一项所述的核酸分子、如权利要求8或9所述的嵌合抗原受体、如权利要求10所述的载体或如权利要求11所述的细胞在制备治疗CD123阳性的血液肿瘤药物中的应用，所述血液肿瘤优选为急性髓系白血病。


13.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1～7中任意一项所述的核酸分子、如权利要求8或9所述的嵌合抗原受体、如权利要求10所述的载体或如权利要求11所述的细胞，以及药学上接受的载体。


14.如权利要求13所述的药物组合物在制备治疗CD123阳性的血液肿瘤药物中的应用，所述血液肿瘤优选为急性髓系白血病。


15.一种治疗血液肿瘤的方法，其特征在于，在所述方法中使用如权利要求1～7中任意一项所述的核酸分子、如权利要求8或9所述的嵌合抗原受体、如权利要求10所述的载体、如权利要求11所述的细胞或如权利要求13所述的药物组合物。


16.根据权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子还同时包含编码靶向其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体的核酸分子；
所述靶向CD123的嵌合抗原受体和所述靶向其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体之间通过2A家族剪切肽连接。


17.根据权利要求16所述的核酸分子，其特征在于，所述其他肿瘤细胞表面抗原为选自CD5、CD4、CD3、CD2、CD52、GD2、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD22、CD33、CD30、CD41、CD45、CD61、CD64、CD68、CD117、CD138、CD267、CD269、CD38、Flt3受...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建祥，王敏，熊冬生，王珍珍，卢杨，饶青，徐颖茜，邢海燕，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院中国医学科学院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12