一种降低Taqman探针荧光背景的方法技术

本发明专利技术公开了一种降低Taqman探针荧光背景的方法，采用固相亚磷酰胺三酯法在全自动DNA合成仪上合成Taqman探针时3端淬灭基团CPG先加盖再脱保护、耦连、加帽、氧化四步循环反应，再将合成板依次用DEA‑ACN混合液和ACN进行处理后，进行氨解，氨解结束后，进行脱洗将合成板中样品洗脱至全新96孔板中后，通过HPLC纯化分离得到探针，该方法在传统固相亚磷酰胺三酯法的脱保护、耦连、加帽、氧化四步循环反应中在首次脱保护前增加加帽步骤以阻止未标上淬灭基团的CPG参与后续反应，避免带荧光标记副产物存在，从而降低Taqman探针荧光背景。

【技术实现步骤摘要】
一种降低Taqman探针荧光背景的方法
本专利技术涉及DNA合成
，具体涉及一种降低Taqman探针荧光背景的方法。
技术介绍
Taqman探针作为核酸检测试剂盒的核心原料，需要高质量来实现检测的精准度，对其低背景荧光、高灵敏度有更高的要求。本专利技术中的Taqman探针合成方法能较好的降低探针荧光背景，提高灵敏度，为高效的RT-PCR核酸检测提供保障。目前化学产品很难做到100％纯正，故Taqman探针3端淬灭基团CPG原料中会存在少量未标记上淬灭基团的CPG，全自动DNA合成仪合成核酸引物探针时经脱保护、耦连、加帽、氧化四步循环反应，得到的Taqman探针中会有纯化过程中不易分离的微量荧光标记副产物存在，在后续qPCR检测中呈现出稍高的背景荧光。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种降低Taqman探针荧光背景的方法。本专利技术要解决的技术问题：采用固相亚磷酰胺三酯法在全自动DNA合成仪上合成Taqman探针时3端淬灭基团CPG先加盖再脱保护，以阻止未标上淬灭基团的CPG参与后续反应，避免带荧光标记产物存在，从而降低Taqman探针荧光背景。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种降低Taqman探针荧光背景的方法，具体包括如下步骤：步骤A1：制备Taqman探针，该探针序列为5’FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ13’，将Taqman探针装填合成柱，将合成柱装入合成板中，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，封闭未标上淬灭基团的CPG后，加入三氯乙酸进行反应，脱去保护基团DMT，获得游离的5′羟基溶液；步骤A2：将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，制得核苷亚磷酸活化中间体，将核苷亚磷酸活化中间体与游离的5′羟基溶液进行缩合反应后，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，终止反应后，加入碘，进行氧化反应，使得脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上后，加入三氯乙酸对5′羟基上的保护基团DMT进行脱保护，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上，再接5′端荧光基团；步骤A3：向合成板中加入DEA-ACN混合液，静置10-15min后，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2-3次，每次离心2-3min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2-3min，得到处理后的合成板；步骤A4：向氨解仪中加入400mL水，将处理后的合成板加入氨解仪，在压强为70-90PSI，温度为90℃的条件下，通入氨基，进行氨解1.5-2h，氨解结束后放掉氨气，拿出合成板冷却至室温后，加入质量分数100％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，离心5min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，离心5min；步骤A5：向离心后的合成板中加入TEA，静置10min后置于全新96孔板垂直上方，在转速为3500r/min的条件下，进行离心5min，将样品洗脱至全新96孔板中后，进行HPLC纯化分离，得到探针。进一步，步骤A3所述的DEA-ACN混合液为体积比为2:8的DEA和ACN混合，DEA-ACN混合液的加入量为200μL，所得质量分数90％的ACN的加入量为300μL。进一步，步骤A4所述的质量分数100％的ACN加入量为200μL，质量分数90％的ACN加入量为200μL。进一步，步骤A5所述的TEA的质量分数为5％，TEA的用量为260μL。本专利技术的有益效果：在传统固相亚磷酰胺三酯法的脱保护、耦连、加帽、氧化四步循环反应中在首次脱保护前增加加帽步骤，以阻止未标上淬灭基团的CPG参与后续反应，避免带荧光标记副产物存在，从而降低Taqman探针荧光背景。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为Taqman探针全波长光谱扫描检测结果示意图；图2为Taqman探针qPCR荧光背景检测结果示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1一种降低Taqman探针荧光背景的方法，具体包括如下步骤：步骤A1：制备Taqman探针，该探针序列为5’FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ13’，将Taqman探针装填合成柱，将合成柱装入合成板中，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，封闭未标上淬灭基团的CPG后，加入三氯乙酸进行反应，脱去保护基团DMT，获得游离的5′羟基溶液；步骤A2：将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，制得核苷亚磷酸活化中间体，将核苷亚磷酸活化中间体与游离的5′羟基溶液进行缩合反应后，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，终止反应后，加入碘，进行氧化反应，使得脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上后，加入三氯乙酸对5′羟基上的保护基团DMT进行脱保护，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上，再接5′端荧光基团；步骤A3：向合成板中加入DEA-ACN混合液，静置10min后，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2次，每次离心2min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2min，得到处理后的合成板；步骤A4：向氨解仪中加入400mL水，将处理后的合成板加入氨解仪，在压强为70PSI，温度为90℃的条件下，通入氨基，进行氨解1.5h，氨解结束后放掉氨气，拿出合成板冷却至室温后，加入质量分数100％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，离心5min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，离心5min；步骤A5：向离心后的合成板中加入TEA，静置10min后置于全新96孔板垂直上方，在转速为3500r/min的条件下，进行离心5min，将样品洗脱至全新96孔板中后，进行HPLC纯化分离，得到探针。实施例2一种降低Taqman探针荧光背景的方法，具体包括如下步骤：步骤A1：制备Taqman探针，该探针序列为5’FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ13’，将Taqman探针装填合成柱，将合成柱装入合成板中，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，封闭未标上淬灭基团的CPG后，加入三氯乙酸进行反应，脱去保护基团DMT，获得游离的5′羟基溶液；步骤A2：将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，制得核苷亚磷酸活化中间体，将核苷亚磷酸活化中间体与游离的5′羟基溶液进行缩合反应后，加入乙酸酐和1-甲基咪唑本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种降低Taqman探针荧光背景的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：/n步骤A1：制备Taqman探针，该探针序列为5’FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ13’，将Taqman探针装填合成柱，将合成柱装入合成板中，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，封闭未标上淬灭基团的CPG后，加入三氯乙酸进行反应，脱去保护基团DMT，获得游离的5′羟基溶液；/n步骤A2：将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，制得核苷亚磷酸活化中间体，将核苷亚磷酸活化中间体与游离的5′羟基溶液进行缩合反应后，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，终止反应后，加入碘，进行氧化反应，使得脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上后，加入三氯乙酸对5′羟基上的保护基团DMT进行脱保护，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上，再接5′端荧光基团；/n步骤A3：向合成板中加入DEA-ACN混合液，静置10-15min后，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2-3次，每次离心2-3min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2-3min，得到处理后的合成板；/n步骤A4：向氨解仪中加入400mL水，将处理后的合成板加入氨解仪，在压强为70-90PSI，温度为90℃的条件下，通入氨基，进行氨解1.5-2h，氨解结束后放掉氨气，拿出合成板冷却至室温后，加入质量分数100％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，离心5min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，离心5min；/n步骤A5：向离心后的合成板中加入TEA，静置10min后置于全新96孔板垂直上方，在转速为3500r/min的条件下，进行离心5min，将样品洗脱至全新96孔板中后，进行HPLC纯化分离，得到探针。/n...

【技术特征摘要】
1.一种降低Taqman探针荧光背景的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
步骤A1：制备Taqman探针，该探针序列为5’FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ13’，将Taqman探针装填合成柱，将合成柱装入合成板中，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，封闭未标上淬灭基团的CPG后，加入三氯乙酸进行反应，脱去保护基团DMT，获得游离的5′羟基溶液；
步骤A2：将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，制得核苷亚磷酸活化中间体，将核苷亚磷酸活化中间体与游离的5′羟基溶液进行缩合反应后，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，终止反应后，加入碘，进行氧化反应，使得脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上后，加入三氯乙酸对5′羟基上的保护基团DMT进行脱保护，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上，再接5′端荧光基团；
步骤A3：向合成板中加入DEA-ACN混合液，静置10-15min后，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2-3次，每次离心2-3min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2-3min，得到处理后的合成板；
步骤A4：向氨解仪中加入400mL水，将处理后的合成板加入氨解仪，在压强为70-90PS...

【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，刘宗文，刘倩，
申请(专利权)人：通用生物系统安徽有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34