达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法和应用技术

本发明专利技术涉及青钱柳的提取物，尤其涉及青钱柳二氯甲烷活性部位和达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法以及应用。所述活性部位为青钱柳的二氯甲烷萃取浓缩液，所述活性部位主要成分为达玛烷型四环三萜类化合物，所述达玛烷型四环三萜类化合物的结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：

【技术实现步骤摘要】
达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法和应用
本专利技术涉及青钱柳的提取物，尤其涉及青钱柳二氯甲烷活性部位和达玛烷型四环三萜化合物(包括3,4-裂环和非裂环两种结构形式)及其提取方法以及应用。
技术介绍
青钱柳[Cyclocaryapaliurus(Bata1)Iljinsk]系胡桃科(Juglaruiaceae)青钱柳属植物，是中国特有的单种属植物，广泛分布于安徽、江苏、浙江等地。20世纪80年代以来，国内外专家学者主要针对青钱柳的资源培育、化学成分、生物活性和产品开发研究等方面进行了大量研究。结果表明，青钱柳具有多种对人体有益的生理活性和药理功能。三萜类化合物(triterpenoids)是自然界中分布广、结构类型多样的一类重要天然产物，具有降糖降压、抗炎、降血脂、抗肿瘤等多种生物活性。研究发现三萜类化合物具有很好的抗炎活性，在不影响细胞活力的情况下，可以抑制NO产生，且其效果优于一氧化氮合酶(NOS)抑制剂，此外对LPS诱导的TNF-α和IL-1β有抑制活性。有研究发现三萜皂苷能显著降低动脉血压，降低自发性高血压大鼠血浆中的肾素活性(PRA)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮(ALD)含量，对肾性高血压及自发性高血压大鼠心肌肥厚具有一定的抑制作用，并且可以逆转自发性高血压大鼠左心室重构的病理状态，其机制分别与调控，AngⅡ/p38MAPK通路诱导的炎症反应和抑制心肌组织炎症因子TGF-β1的表达有关。青钱柳叶含有多种药用化学成分，包括胡萝卜素、蛋白质、黄酮类、多糖类、三萜类等化合物，其中达玛烷型三萜和异戊烯基黄酮因其结构和药理活性的多样性而受到广泛关注。目前关于这两类成分多集中于降糖和炎症的研究，关于其他方面的活性以及机制研究较少，因此具体阐明达玛烷型三萜和异戊烯基黄酮其他应用活性及作用机制对广泛的临床应用和创新药物研发具有重大意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术目的是提供青钱柳二氯甲烷活性部位和达玛烷型四环三萜化合物的提取方法及应用，对抗类风湿性关节炎活性成分和药效物质基础进行系统研究。为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下：一种达玛烷型四环三萜化合物(包括3,4-裂环和非裂环两种结构形式)，其结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：其中，R1选自氢、C1-C6烷基；R2选自氢、L-阿拉伯糖、D-鸡纳糖、D-葡萄糖；R3选自R4和R5独立的选自L-阿拉伯糖、D-鸡纳糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-呋喃阿拉伯糖；R6选自优选的，所述达玛烷型四环三萜化合物，结构式如下：本专利技术还提供一种从青钱柳提取上述达玛烷型四环三萜化合物的方法，包括以下步骤：S1、将青钱柳叶用乙醇/水加热回流提取，浓缩得浸膏；S2、将浸膏用水分散，用二氯甲烷萃取，并将萃取液浓缩，得二氯甲烷萃取浓缩液；S3、采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对二氯甲烷萃取浓缩液进行分析及分离纯化。优选的，S1中，青钱柳叶经过干燥粉碎处理。优选的，S1中，乙醇的浓度为70％，青钱柳叶质量与乙醇的比值为1:10，加热的温度为120℃，加热的时间为2h，浓缩的温度为60℃，浓缩的时间为2-3天。优选的，S2中，利用二氯甲烷萃取三次，青钱柳叶质量与每次使用的二氯甲烷体积的比值为1:10，浓缩的温度为60℃，浓缩的时间为24-48小时。优选的，S3中，二氯甲烷部位经硅胶柱层析CH2Cl2:CH3OH(100:1-0:100)梯度洗脱，10％EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色，不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析，浓缩合并得到9个部位(A-I)；A-I部位TLC薄层分析，10％浓硫酸/乙醇加热显色，其中Fr.I薄层板显示紫红色条带，HPLC-DAD分析主要为末端吸收，初步确定I部位为三萜类富集部位；首先对FrI采用聚酰胺柱色谱，去除色素，鞣质等干扰性成分，接着采用硅胶柱层析、小孔树脂柱层析和反向ODS柱层析，整个分离过程用UPLC-MS/MS方法对三萜进行追踪，10％EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色及HPLC-DAD对样品进行分析，对达玛烷型四环三萜化合物有效分离；最后采用半制备高效液相对目标化合物进行纯化。本专利技术还要求保护一种活性部位，所述活性部位为如上述的二氯甲烷萃取浓缩液。本专利技术还要求保护如上述的活性部位在制备抗类风湿性关节炎的药物中的应用。进一步的，达玛烷型四环三萜化合物的分离纯化过程为：本专利技术采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对二氯甲烷萃取浓缩液进行追踪、分析及分离纯化。二氯甲烷部位取400g样品采用硅胶柱层析并以CH2Cl2:CH3OH系统(100:1-0:100)梯度洗脱，得到的流份用10％EtOH-H2SO4显色剂对TLC斑点进行显色，不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析，最终浓缩合并得到10个馏分(I-X)。对这10个馏分依次进行TLC薄层分析及HPLC分析，发现IX和X两个部位薄层板显示紫红色条带，而HPLC-DAD分析主要为末端吸收，初步确定这两个部位为三萜类富集部位，所以在该课题的进行中主要对这两部分进行分离。将IX部位通过聚酰胺柱(乙醇/水,0-95％)洗脱，得到五个组分(A-E)。IXA(33.2g)进一步用硅胶柱色谱纯化(CH2Cl2-MeOH,50:1-0:100),接着用C18反相柱色谱柱层析,甲醇-水体系梯度洗脱(20％-100％)得到化合物1(2.3mg)和化合物14(4.5mg)。将IXB,IXC合并,继续用C18反相柱分离,使用MeOH/H2O的梯度系统分离,得到五个馏分(IXBC-1-IXBC-5)。IXBC-2(3.5g)通过MCI小孔树脂柱层析,甲醇-水体系(20％-100％)洗脱,得到六个亚组分(IXBC-2-a-IXBC-2-f)。IXBC-2-b通过半制备液相色谱分离得到化合物3(2.0mg),化合物4(3.2mg)；IXBC-2-c通过半制备液相色谱分离得到化合物20(1.8mg),化合物22(1.5mg)。将组分IXD(78.2g)采用硅胶柱层析,用EtOAc-MeOH体系洗脱,得到8个亚组分(IXD-1-IXD-8)。IXD-3(18.4g)通过硅胶柱色谱用CH2Cl2-MeOH体系洗脱进一步纯化,得到四个组分(IXD-3-a-IXD-3-d)。随后，IXD-3-b通过半制备液相色谱分离出化合物18(3.8mg)，IXD-3-c通过半制备液相色谱分离出化合物23(3.8mg)和15(4.8mg)。IXD-4(23.0g)通过MCI小孔树脂柱层析,甲醇-水体系(20％-100％)洗脱,得到六个亚组分(IXD-4-a-IXD-4-e)。通过半制备HPLC从IXD-4-c分离化合物13(8.4mg)和26(4.5mg)，从IXD-4-d分离化合物9(5.6mg)和化合物12(3.8mg)。将馏分X(60g)同样通过聚酰胺色谱柱柱层析,甲醇-水体系梯度洗脱(0-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种活性部位，其特征在于，所述活性部位为青钱柳的二氯甲烷萃取浓缩液，所述活性部位含有达玛烷型四环三萜类化合物，所述达玛烷型四环三萜类化合物的结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：/n

【技术特征摘要】
20200420 CN 20201031224721.一种活性部位，其特征在于，所述活性部位为青钱柳的二氯甲烷萃取浓缩液，所述活性部位含有达玛烷型四环三萜类化合物，所述达玛烷型四环三萜类化合物的结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：



其中，R1选自氢、C1-C6烷基；R2选自氢、L-阿拉伯糖、D-鸡纳糖、D-葡萄糖；R3选自
R4和R5独立的选自L-阿拉伯糖、D-鸡纳糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-呋喃阿拉伯糖；R6选自


2.根据权利要求1所述的活性部位，所述达玛烷型四环三萜化合物的结构式如下：








3.一种从青钱柳提取达玛烷型四环三萜化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将青钱柳叶用乙醇/水加热回流提取，浓缩得浸膏；
S2、将浸膏用水分散，用二氯甲烷萃取，并将萃取液浓缩，得二氯甲烷萃取浓缩液；
S3、采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对二氯甲烷萃取浓缩液进行分析及分离纯化。


4.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，S1中，乙醇的浓度为70％，青钱柳叶质量与乙醇的比值为1:10，加热的温度为120℃，加热的时间为2h，浓缩的温度为60℃，浓缩的时间为2-3天。


5.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，S2中，利用二氯甲烷萃取三次，青钱柳叶质量与每次使用的二氯甲烷体积的比值为1:10，浓缩的温度为60℃，浓缩的时间...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐康平，吴建平，陆士娟，王钰艳，王文宣，陈祖辉，李桂花，何小爱，曾普华，桂瑞，刘翊芊，欧赛玉，魏希凡，
申请(专利权)人：中南大学，湖南清雅健康服务有限公司，湖南和然生物科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43