一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT提取和分析方法技术

本发明专利技术公开了医疗技术领域的一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT提取和分析方法，该可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的提取方法包括如下步骤：将走马胎植株风干磨成粉，通过过滤器过滤；将粗粉加入乙醇中，室温浸泡一周；采用旋转蒸发法制备走马胎粉乙醇提取物，重复三次；取适量乙醇提取物用纯水稀释，用等体积的乙酸乙酯反复萃取样品，直到乙酸乙酯层无色为止；取乙酸乙酯部分，以硅胶、MCI凝胶、nmsil50‑100C18为填料，各种有机溶剂为流动相，按相溶规则分离化合物，提取HEMXT提取物，本发明专利技术具有一定的抗氧化，降血糖能力，走马胎HEMXT提取物能够有效的抑制肝癌细胞迁移，阻滞细胞周期于S期。

【技术实现步骤摘要】
一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT提取和分析方法
本专利技术涉及医疗
，具体为一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT提取和分析方法。
技术介绍
癌症是人类健康危害的重大疾病之一，给全人类造成重大负担[1]。葡萄糖是肿瘤细胞赖以存活的主要能量来源，但是肿瘤细胞处于缺乏氧气环境往往需要通过对葡萄糖无氧代谢获得能量。同质量葡萄糖所提供的能量不到正常细胞的10％，因而对葡萄糖的需求剧增。细胞膜表面的葡萄糖转运蛋白1(GlucoseTransporterType1，GLUT1)负责将血液或组织液内的葡萄糖运输到细胞内。在缺氧条件下，肿瘤细胞为了维持基本的代谢，常特异性地过表达GLUT1以摄入更多的葡萄糖酵解。因此GLUT1成为肿瘤细胞的标志物。若GLUT1被抑制，葡萄糖摄入减少，则糖酵产能减少，肿瘤细胞增殖可能停止，PI3K/AKT信号通路是介导细胞能量代谢的核心信号通路之一，在转录水平调节多个糖代谢相关基因的表达。被磷酸化激活的AKT可在通过磷酸化激活或抑制其下游多个靶蛋白，如Bad、Caspase9、NF-κB、Mtor、GSK3，irs-1等。AKT的活化也与肿瘤密切相关：在肿瘤的发生与存活、肿瘤细胞的代谢、肿瘤细胞周期调控、肿瘤肿瘤血管生成、以及癌细胞的侵袭转移中都起着关键作用，PI3K/AKT信号通路还可影响葡萄糖转运蛋白GLUT1的表达和在膜上的分布，从而调控葡萄糖入胞和代谢，影响肿瘤细胞发展。因此，靶向AKT通路的抑制剂或药物已成为研究热点，具有广大的应用前景。如AKT抑制剂Palomid529(P529)和哌立福辛，具有抗肿瘤和辐射敏感性的作用。抗肿瘤血管生成为肿瘤的治疗提供了新的契机，中药均为有效的血管生成抑制剂，与传统的肿瘤治疗相比，抗肿瘤血管生成治疗的最大特点在于它不但具有良好的特异性，而且克服了药物达到肿瘤组织的不足和肿瘤耐药性等问题。而我国传统的中医药因其抗肿瘤效应、放化疗增敏以及减轻放化疗毒副方面独具效果而越来越受到人们的重视。我国具有丰富的中草药资源和悠久的中草药研究历史。走马胎是紫金牛科紫金牛属植物，作为广西特色瑶药，具有祛风湿、壮筋骨、活血祛瘀和治疗痈疽溃疡等的功效，新近研究还表明走马胎对多种肿瘤具有明显的抗肿瘤作用，但目前对其抑瘤机制尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT提取和分析方法，以解决上述
技术介绍
中提出的走马胎是紫金牛科紫金牛属植物，作为广西特色瑶药，具有祛风湿、壮筋骨、活血祛瘀和治疗痈疽溃疡等的功效，新近研究还表明走马胎对多种肿瘤具有明显的抗肿瘤作用，但目前对其抑瘤机制尚不清楚的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的提取方法，该可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的提取方法包括如下步骤：S1：将走马胎植株风干磨成粉，通过过滤器过滤；S2：将粗粉加入乙醇中，室温浸泡一周；S3：采用旋转蒸发法制备走马胎粉乙醇提取物，重复三次；S4：取适量乙醇提取物用纯水稀释，用等体积的乙酸乙酯反复萃取样品，直到乙酸乙酯层无色为止；S5：取乙酸乙酯部分，以硅胶、MCI凝胶、nmsil50-100C18为填料，各种有机溶剂为流动相，按相溶规则分离化合物，提取HEMXT提取物。优选的，所述步骤S1中的过滤器为400目过滤器。优选的，所述步骤S3中的蒸发温度为60℃。一种如权利要求1所述的可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的分析方法，该可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的分析方法包括如下步骤：A1：细胞增殖实验：将细胞以胰蛋白酶室温消化后，用培养液配成单细胞悬液，将细胞接种于培养板中，继续培养于细胞培养箱，往细胞培养液内加入HEMXT，培养3天后，弃去细胞培养液，再加入检测试剂，继续培养2h后，置光栅型连续波长酶标仪，读取各孔的吸光值；A2：动物水平在体瘤抑制实验：对裸鼠注射癌细胞，继续饲养，待成瘤后用于实验，在肿瘤组织附近每隔一段时间注射HEMXT水溶液，一段时间后，处死小鼠，取出肿瘤组织，用多聚甲醛-蔗糖溶液固定一段时间，然后冰冻切片，用Tunnel试剂盒对肿瘤切片染色，计算各组肿瘤切片内发荧光细胞的个数；A3：细胞周期实验：将细胞以胰蛋白酶室温消化后，接种到培养皿中，置于孵育箱中培养一段时间后收集细胞，采用冰冻乙醇固定保存，用PBS洗去固定液，加入染液，避光孵育一段时间，染色后筛网过滤，用流式细胞仪检测，用专用软件进行测定与分析；A4：克隆形成实验：将细胞以胰蛋白酶室温消化后，用培养液配成单细胞悬液，接种于培养板中，继续培养于细胞培养箱，培养一段时间后终止实验后弃去上清液，用PBS小心浸洗，加多聚甲醛固定一段时间后，弃去固定液，加入结晶紫染色液染色一段时间后，洗去染色液，空气干燥，拍摄图像；A5：凋亡相关因子检测：取各组细胞或肿瘤，用RIPA裂解液提取细胞或组织总蛋白，测定浓度后加上样缓冲液煮沸5min，然后SDS-PAGE，用抗体标记检测各组Caspase3、8、9以及BCL-2，Bax的表达差异；A6：葡萄糖摄取实验：将癌细胞置于含有葡萄糖的DMEM中，细胞用KRPH缓冲液处理，通过与脱氧葡萄糖一起温育，测定葡萄糖摄取，一段时间后，用PBS洗涤细胞三次，停止反应，然后将细胞在TritonX-100中溶解，并将等分试样进行闪烁计数和Bradford蛋白质测定；A7：乳酸产量及葡萄糖消耗实验：将细胞在不含酚红的DMEM中培养一段时间，收集培养基用于乳酸或葡萄糖测量，使用乳酸测定试剂盒进行乳酸检测，使用葡萄糖测定试剂盒测定葡萄糖水平。优选的，所述步骤A1中的胰蛋白酶含量为0.25％，所述培养液为含10％FBS的DMEM培养液。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术具有一定的抗氧化，降血糖能力，走马胎HEMXT提取物能够有效的抑制肝癌细胞迁移，阻滞细胞周期于S期，抗癌机制可能为上调Bax，下调Bcl-2，活化caspase3，8，9，下调p-ERK，P-AKT，下调p21，p27。附图说明图1为本专利技术提取方法示意框图；图2为本专利技术分析方法示意框图；图3为本专利技术为过表达δ的pBluescriptIIKS(+/-)BAI1-Cre–δ基因打靶载体构建图；图4为本专利技术为SHZ-88中绿色荧光蛋白基因loxP-STOP-loxP-GFP-express被转入的BAI1-Cre基因重组示意图图5为本专利技术为HEMXT提取物48，72h对HepG2细胞抑制率图；图6为本专利技术为HEMXT提取物对HepG2细胞形态的影响图；图7为本专利技术为细胞周期变化；图8为本专利技术为HEMXT提取物Bax，Bcl-2蛋白表达的影响图；图9为本专利技术为HEMXT提取物caspase3.8.9表达的影响图；图10为本专利技术为PCR分析结果图；图11为本专利技术为ERK，AKT蛋白表达量变化情况图。具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的提取方法，其特征在于：该可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的提取方法包括如下步骤：/nS1：将走马胎植株风干磨成粉，通过过滤器过滤；/nS2：将粗粉加入乙醇中，室温浸泡一周；/nS3：采用旋转蒸发法制备走马胎粉乙醇提取物，重复三次；/nS4：取适量乙醇提取物用纯水稀释，用等体积的乙酸乙酯反复萃取样品，直到乙酸乙酯层无色为止；/nS5：取乙酸乙酯部分，以硅胶、MCI凝胶、nmsil50-100C18为填料，各种有机溶剂为流动相，按相溶规则分离化合物，提取HEMXT提取物。/n

【技术特征摘要】
1.一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的提取方法，其特征在于：该可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的提取方法包括如下步骤：
S1：将走马胎植株风干磨成粉，通过过滤器过滤；
S2：将粗粉加入乙醇中，室温浸泡一周；
S3：采用旋转蒸发法制备走马胎粉乙醇提取物，重复三次；
S4：取适量乙醇提取物用纯水稀释，用等体积的乙酸乙酯反复萃取样品，直到乙酸乙酯层无色为止；
S5：取乙酸乙酯部分，以硅胶、MCI凝胶、nmsil50-100C18为填料，各种有机溶剂为流动相，按相溶规则分离化合物，提取HEMXT提取物。


2.根据权利要求1所述的一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的提取方法，其特征在于：所述步骤S1中的过滤器为400目过滤器。


3.根据权利要求1所述的一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的提取方法，其特征在于：所述步骤S3中的蒸发温度为60℃。


4.一种如权利要求1所述的可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的分析方法，其特征在于：该可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的分析方法包括如下步骤：
A1：细胞增殖实验：将细胞以胰蛋白酶室温消化后，用培养液配成单细胞悬液，将细胞接种于培养板中，继续培养于细胞培养箱，往细胞培养液内加入HEMXT，培养3天后，弃去细胞培养液，再加入检测试剂，继续培养2h后，置光栅型连续波长酶标仪，读取各孔的吸光值；
A2：动物水平在体瘤抑制实验：对裸鼠注射癌细胞，继续饲养，待成瘤后用于实验，在肿瘤组织附近每隔一段时间注射HEMXT水溶液，一段时间后，处死小鼠，取出肿瘤组织，用多聚甲醛-蔗糖溶液固定一段时间，然后冰冻切片...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱开梅，邹珍友，顾生玖，姚志仁，顾超豪，
申请(专利权)人：桂林医学院，
类型：发明
国别省市：广西;45