一株细菌纤维素产生菌株、筛选方法及细菌纤维素的制备技术

本发明专利技术公开了一种细菌纤维素产生菌株及其鉴定方法，该菌株命名为驹形杆菌(Komagataeibacter sp.171129Z2‑3)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.17276。该菌株为革兰氏阴性、短杆状细菌，具备碳源和氮源选择范围广、生长速度快、菌体活性强、产纤维素能力强等特点，能够在静置培养和振荡培养时产生大量细菌纤维素，在发酵4天时产量分别可达5.12g/L和2.571g/L。通过生理生化特征、16SrDNA、dnaK、groEL和rpoB基因序列分析及基因组平均核苷酸指数(ANI)分析，确定该菌株为驹形杆菌。在细菌纤维素的工业化生产方面具有良好的实施前景。

【技术实现步骤摘要】
一株细菌纤维素产生菌株、筛选方法及细菌纤维素的制备
本专利技术属于微生物
，具体涉及一株细菌纤维素产生菌株的分离、鉴定以及细菌纤维素的动态振荡发酵培养。
技术介绍
细菌纤维素(BacterialCellulose，BC)是由微生物发酵而形成纤维素。它是由葡糖通过β-1，4-糖苷键聚合形成的平行直链分子，无分支结构，分子内与分子间的氢键形成具有立体网状结构的一种生物大分子，属于微生物初级代谢产物的一种，主要起到维持细菌形态、保护菌体不受外界损伤的作用。与植物纤维素相比，BC不含木质素和半木质素使其具有高度的化学纯度、结晶度(80-90％)、吸水能力和聚合度(高达8000)。良好的物理特性、生物相容性及可降解性使其在众多新型材料中脱颖而出，能够广泛应用于食品、电子工业和纺织等各个领域中。现已有大量研究报道，驹形杆菌属(Komagataeibacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、假单胞杆菌属(Prudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、产碱杆菌属(Alcaligcncs)、气杆菌属(Aerobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)和八叠球菌属(Sarcina)共9个属中的某些种具有产细菌纤维素的能力。其所产的凝胶膜状物质统称为细菌纤维素，但其中产量较高、能够应用于工业化生产的仅为驹形杆菌属一种。其中木葡糖驹形杆菌E25(K.xylinusE25)是最早发现，也是研究较为透彻的产纤维素菌种，是目前研究报道中合成细菌纤维素能力最强、产量最高的微生物菌种。然而，上述菌株在实际工业化生产应用过程中都存在可利用碳源单一、生长和产纤维素速度慢、动态振荡发酵培养产量低下等问题。为进一步扩大产纤维素菌种范围，降低工业生产成本，缩短工业生产周期，筛选出可以快速产优良纤维素且遗传代谢稳定菌株对于扩大BC产能具有重要意义。此外，目前对BC产生菌株的鉴定主要是通过结合16SrDNA和生理生化的方法进行鉴定，该方法存在难以确定相邻种属的局限性，探寻新的准确分类产BC菌种的方法对于菌株后续的改造或研究具有重要意义。
技术实现思路
针对现有细菌纤维素工业化困难的生产现状及技术需求，本专利技术的目的是为了提供一株产纤维素速度快、动态发酵产量高、活性强的菌株。其次，本专利技术还提供一种产纤维素速度快、动态发酵产量高、活性强的菌株筛选方法。进一步地，本专利技术提供一种通过分子生物学鉴定技术，鉴定分离得到的产纤维素菌株种属的方法。进一步地，本专利技术提供一种提取纯化菌株生产纤维素的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：本专利技术提供了一株从枣中分离得到的细菌纤维素产生菌株，所述菌株为驹形杆菌(Komagataeibactersp.171129Z2-3)，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.17276，保藏日期为2019年3月1日。所述菌株为革兰氏阴性好氧菌，短杆状，不具有运动性，为细菌纤维素生产菌。区别于现有细菌纤维素生产菌株，具备碳源和氮源选择范围广、生长速度快、菌体活性强、产纤维素能力强等特点，具体包括：(1)生长速度快：振荡培养条件下较现有菌株提前4h进入对数生长期；(2)细菌纤维素生产能力强：较现有菌株动态产量高出60％、静置产量高出258％；(3)可利用碳源和氮源广：可利用现有纤维素生产菌株不可利用的乙醇、甘油、麦芽糖、木糖、甘露醇等；(4)能够在静置培养和振荡培养时产生大量细菌纤维素，在发酵4天时产量分别可达5.12g/L和2.571g/L(现有静置培养技术产量为1.427g/L，振荡培养技术产量为1.611g/L)。在静置培养下所产纤维素结晶度高于振荡培养条件。本专利技术还提出了一种细菌纤维素产生菌株的高效筛选方法，包括以下步骤：(1)产纤维素菌种的一次富集：采集腐败水果样品，取果实腐败部分于一次富集培养基的玻璃试管中，28℃-37℃(优选30℃)静置培养至液面上长出凝胶状薄膜；(2)产纤维素菌种的分离：取步骤(1)中所述的薄膜，用无菌生理盐水振荡洗涤2-3次，梯度稀释，涂布至HS平板培养基，28℃-37℃(优选30℃)倒置培养3-5天；(3)产纤维素菌种的筛选：取步骤(2)倒置培养后的HS平板培养基，挑取单个菌落，接入装有HS液体培养基的小试管中，28℃-37℃(优选30℃)静置培养至长出凝胶状薄膜；(4)产纤维素菌种的二次富集：取步骤(3)静置培养的凝胶状薄膜，用无菌生理盐水洗涤2-3次，将纤维素薄膜置于HS平板培养基上涂布，28℃-37℃(优选30℃)静置培养3-5天；(5)产纤维素菌种的纯化及保存：刮取步骤(4)培养好的菌苔，接入HS液体培养基中，28℃-37℃(优选30℃)振荡培养，确定为单一的纯菌种，得到所述优势驹形杆菌。菌种以甘油管形式-80℃保存；(6)产纤维素菌种的验证：挑取步骤(5)在HS液体培养基中培养的菌落，接入发酵培养基中进行纤维素生产验证。步骤(1)中，所述腐败水果包括但不限于自然腐败水果，选自葡、猕猴桃、梨、枣子、橘子、黑布林、橙子、李子、苹果、草莓、西瓜中的至少一种。步骤(1)中，所述一次富集培养基成分及质量/体积百分比(w/v)为：甘油2-5％，蛋白胨0.2-0.7％，酵母粉0.2-0.7％，磷酸氢二钠0.2-0.5％，一水合柠檬酸0.1-0.2％，纳他霉素0.1-0.4％，其余为水，调节pH为3.0-6.0。优选为，甘油2％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，纳他霉素0.1％，pH为4.0。步骤(1)中，所述静置培养的时间为2-10天；优选地，为7天。步骤(2)中，所述HS平板培养基成分及质量/体积百分比(w/v)为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-10％，酵母粉0.1-10％，磷酸氢二钠0.1-10％，一水合柠檬酸0.1-10％，琼脂粉1.0-10％，其余为水，调节pH为6.0-7.0。优选为，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，琼脂粉1.8％，pH为6.0。步骤(2)中，所述倒置培养的时间优选地，为3天。步骤(3)中，所述HS液体培养基成分及质量/体积百分比(w/v)为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-1％，酵母粉0.1-1％，磷酸氢二钠0.1-1％，一水合柠檬酸0.1-1％，其余为水，调节pH为6.0-7.0。优选为，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，其余为水，pH为6.0。步骤(3)中，所述静置培养的时间为2-10天；优选地，为7天。步骤(3)中静置培养得到的凝胶状薄膜应比步骤(1)中培养得到的凝胶状薄膜厚度更为均匀，颜色更为透亮。步骤(4)中，所述HS平板培养基成分及质量/体积本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细菌纤维素高产菌株，其特征在于，所述菌株为驹形杆菌Komagataeibactersp.171129Z2-3，于2019年3月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.17276。/n

【技术特征摘要】
1.一种细菌纤维素高产菌株，其特征在于，所述菌株为驹形杆菌Komagataeibactersp.171129Z2-3，于2019年3月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.17276。


2.根据权利要求1所述的细菌纤维素高产菌株，其特征在于，所述菌株的16SrDNA的基因序列如SEQIDNo.3所示，所述dnaK、groEL和rpoB的基因序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6所示。


3.根据权利要求1所述的细菌纤维素高产菌株，其特征在于，所述菌株为革兰氏阴性好氧菌，短杆状，不具有运动性，生长速度快，可利用多种碳源和氮源生长，为细菌纤维素生产菌。


4.一种根据权利要求1所述的细菌纤维素产生菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)产纤维素菌种的一次富集：采集果实腐败部分于一次富集培养基中，28℃-37℃静置培养至长出凝胶状薄膜；
(2)产纤维素菌种的分离：取步骤(1)中所述的薄膜，用生理盐水振荡洗涤，梯度稀释，涂布至HS平板培养基，28℃-37℃倒置培养3-5天；
(3)产纤维素菌种的筛选：取步骤(2)倒置培养后的HS平板培养基，挑取单菌落，接入装有HS液体培养基的小试管中，28℃-37℃静置培养至长出凝胶状薄膜；
(4)产纤维素菌种的二次富集：取步骤(3)静置培养的凝胶状薄膜，用无菌生理盐水洗涤，将纤维素薄膜贴于HS平板培养基上涂布，28℃-37℃静置培养3-5天；
(5)产纤维素菌种的纯化及保存：刮取步骤(4)培养好的菌苔，接入HS液体培养基中，28℃-37℃振荡培养，确定为单一的纯菌种，得到所述优势驹形杆菌。


5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述果实选自葡、猕猴桃、梨、枣子、橘子、黑布林、橙子、李子、苹果、草莓、西瓜中的至少一种。


6.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述一次富集培养基成分及质量/体积百分比w/v为：甘油2-5％，蛋白胨0.2-0.7％，酵母粉0.2-0.7％，磷酸氢二钠0.2-0.5％，水合柠檬酸0.1-0.2％，纳他霉素0.1-0.4％，调节pH为3.0-6.0。


7.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述HS液体培养基成分及质量/体积百分比w/v为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-1％，酵母粉0.1-1％，磷酸氢二钠0.1-1％，一水合柠檬酸0.1-1％，其余为水，调节pH为6.0-7.0；和/或，所述HS平板培养基成分及质量/体积百分比w/v为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-10％，酵母粉0.1-10％，磷酸氢二钠0.1-10％，一水合柠檬酸0.1-10％，琼脂粉1.0-10％，其余为水，调节pH为6.0-7.0。


8.一种按权利要求4-7之任一项所述的筛选方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：易正芳，高红亮，陆婷芬，黄婕，蒋德明，刘明耀，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31