黑木耳凝集素的提取方法技术

黑木耳凝集素的提取方法，它涉及一种黑木耳凝集素的提取方法。本发明专利技术是为了提供一种黑木耳凝集素的提取方法。本方法：一、制备黑木耳凝集素粗提液3MTHS1‑0；二、制备上清液3MTHS1‑1；三、解离；四、制备溶液3MTHS1‑2；五、制备提取液1；六、制备提取液2；七、将提取液1、提取液2和溶液3MTHS1‑2合并，进行5kDa超滤除盐，凝缩至2mL，再用10kDa的超滤离心管以4400r/min继续超滤至0.5mL，超滤过程中加水除盐3次，冷冻干燥，即得黑木耳凝集素。本发明专利技术提取的黑木耳凝集素对RAW264.7细胞无细胞毒性，而且可以提高RAW264.7细胞的增殖活性、核酸代谢活性和吞噬能力。具有免疫调节活性。本发明专利技术属于凝集素的提取领域。

【技术实现步骤摘要】
黑木耳凝集素的提取方法
本专利技术涉及一种黑木耳凝集素的提取方法。
技术介绍
黑木耳是常见的食用菌,不仅营养丰富,还具有众多的生物活性。近年来对黑木耳多糖研究较多,对于其他成分研究较少，凝集素(Lectin)是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球(含血型物质)，故名凝集素。常用的为植物凝集素(Phytoagglutin，PNA)，通常以其被提取的植物命名。凝集素是动物细胞和植物细胞都能够合成和分泌的、能与糖结合的蛋白质，在细胞识别和粘着反应中起重要作用，主要是促进细胞间的粘着。凝集素具有一个以上同糖结合的位点，因此能够参与细胞的识别和粘着，将不同的细胞联系起来。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供一种黑木耳凝集素的提取方法。黑木耳凝集素的提取方法按照以下步骤进行：一、称取干燥的黑木耳5g，加入100mL的磷酸盐缓冲液，在捣碎机中充分搅碎至粘稠的匀浆，每5min搅碎2次，两次之间将黑木耳匀浆放入冰浴中制冷3min，将黑木耳匀浆以5000r/min冷冻离心30min，收集上清液后采用四层FN15膜高压过滤，滤液为黑木耳凝集素粗提液3MTHS1-0；二、将25mL3MTHS1-0与25mL猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B充分混合，于6℃搅拌过夜，次日以3000r/min离心5min，得到上清液3MTHS1-1；三、将步骤二离心后的下层液分别用10mLPBS缓冲液洗三次，以3000r/min离心速率离心5min，弃去上清液；四、解离：向步骤三所得的溶液中加入10mL甘氨酸浓度为0.1mol/L、NaCl浓度为1mol/L、pH值为3.0的溶液，充分摇匀10min，以3000r/min离心速率离心5min，在得到的上清中加入Tris-HCl缓冲溶液；五、重复步骤四三次，并将三次得到的溶液合并，得到溶液3MTHS1-2；六、向步骤四中弃去上清液后的溶液中加入2ml浓度为1mol/L、pH值为7.8的Tris-HCl缓冲溶液和25mLPBS缓冲溶液，以3000r/min离心5min，清洗2次；七、将3MTHS1-1按照步骤二-步骤五的步骤重复提取，得到提取液1；八、将3MTHS1-0按照步骤二-步骤五的步骤重复提取，得到提取液2；九、将提取液1、提取液2和溶液3MTHS1-2合并，进行5kDa超滤除盐，凝缩至2mL，再用10kDa的超滤离心管以4400r/min继续超滤至0.5mL，超滤过程中加水除盐3次，冷冻干燥，即得黑木耳凝集素。步骤一中所述磷酸盐缓冲液浓度为10mmol/L、pH值为7.6。步骤四中按照每10mL上清中加入1mLTris-HCl缓冲溶液的比例加入Tris-HCl缓冲溶液。步骤四中所述Tris-HCl缓冲溶液浓度为1mol/L、pH值为7.8。用全自动氨基酸分析仪分析黑木耳凝集素中氨基酸组分，发现黑木耳凝集素含有较多酸性氨基酸，天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)分别为11.83％和13.46％。但黑木耳凝集素含碱性氨基酸较少，赖氨酸(Lys)含量为2.03％、组氨酸(His)含量为3.14％和精氨酸(Arg)含量为2.42％。黑木耳凝集素对RAW264.7细胞无细胞毒性，而且可以提高RAW264.7细胞的增殖活性、核酸代谢活性和吞噬能力。首次对黑木耳凝集素进行免疫活性分析，发现黑木耳凝集素具有免疫调节活性，且以不依赖LPS的方式能够刺激RAW264.7细胞调节炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌、NO的分泌以及iNOS、COX-2蛋白的分泌；LPS耐受性可降低黑木耳凝集素分泌炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α，LPS耐受性不会影响黑木耳凝集素对NO的分泌。黑木耳凝集素可上调MAPK通路关键蛋白ERK1/2和p38磷酸化水平，通过MAPK通路分泌炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α及NO。黑木耳凝集素可上调NF-κB通路关键蛋白NF-κBp50和NF-κBp65上调，可通过NF-κB通路分泌炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α及NO。专利技术点：首次从黑木耳中提取出一种新型凝集素LAA，其分子量为20KDa，对黑木耳凝集素分析氨基酸组分，丰富了食用菌凝集素的种类。首次对黑木耳凝集素进行免疫活性研究，发现黑木耳凝集素以不依赖LPS的形式促进IL-1β、IL-6、TNF-α、NO、iNOS和COX-2的分泌。本专利技术首次探索出黑木耳凝集素可以通过MAPK通路和NF-κB通路上调IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子和NO的产生。为免疫调节药物的研发以及黑木耳的开发利用奠定坚实的理论基础。附图说明图1是实验一中黑木耳凝集素相对分子质量测试图；图2是实验一中标准物质测试曲线图；图3是实验一中黑木耳凝集素蛋白质鉴定一级质谱图；图4是实验一中黑木耳凝集素蛋白质鉴定二级质谱图；图5是实验一中用Uniprot数据库比较图；图6是实验一中黑木耳凝集素的温度依赖性图；图7是实验一中黑木耳凝集素的温度稳定性图；图8是实验一中黑木耳凝集素的血凝集反应结果图；图9是实验一中黑木耳凝集素对RAW264.7细胞毒性影响图；图10是实验一中黑木耳凝集素处理RAW264.7细胞形态变化的倒置显微镜图片(200×)，图中A:阴性对照；B：1μg/mLLPS；C-I为黑木耳凝集素浓度为：1,5,10,15,25,50,100μg/mL；图11是实验一中黑木耳凝集素对RAW264.7细胞增殖活性影响图；图12是实验一中黑木耳凝集素对RAW264.7细胞吞噬能力影响图；图13是实验一中不同浓度黑木耳凝集素对RAW264.7细胞核酸代谢活性影响图；图14是实验一中黑木耳凝集素对RAW264.7细胞分泌炎性因子IL-1β释放量的影响图；图15是实验一中黑木耳凝集素对RAW264.7细胞分泌炎性因子IL-6释放量的影响图；图16是实验一中黑木耳凝集素对RAW264.7细胞分泌炎性因子TNF-α释放量的影响图；图17是实验一中黑木耳凝集素对RAW264.7细胞细胞产生NO的影响图；图18是实验一中不同浓度黑木耳凝集素对RAW264.7细胞表达iNOS蛋白结果图；图19是实验一中不同浓度黑木耳凝集素对RAW264.7细胞产生COX-2蛋白表达结果图；图20是实验一中黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生炎症因子IL-1β释放量的影响图；图21是实验一中黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生炎症因子IL-6释放量的影响图；图22是实验一中黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生炎症因子TNF-α释放量的影响图；图23是实验一中黑木耳凝集素加热处理后对RAW264.7细胞产生炎性因子IL-1β释放量的影响图；图24是实验一中黑木耳凝集素加热处理后对RAW264.7细胞产生炎性因子IL-6释放量的影响图；图25是实验一中黑木耳凝集素加热处理后对RAW264.7细胞产生炎性因子TNF-α释放量的影响图；图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.黑木耳凝集素的提取方法，其特征在于所述黑木耳凝集素的提取方法按照以下步骤进行：/n一、称取干燥的黑木耳5g，加入100mL的磷酸盐缓冲液，在捣碎机中充分搅碎至粘稠的匀浆，每5min搅碎2次，两次之间将黑木耳匀浆放入冰浴中制冷3min，将黑木耳匀浆以5000r/min冷冻离心30min，收集上清液后采用四层FN15膜高压过滤，滤液为黑木耳凝集素粗提液3MTHS1-0；/n二、将25mL 3MTHS1-0与25mL猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B充分混合，于6℃搅拌过夜，次日以3000r/min离心5min，得到上清液3MTHS1-1；/n三、将步骤二离心后的下层液分别用10mLPBS缓冲液洗三次，以3000r/min离心速率离心5min，弃去上清液；/n四、解离：向步骤三所得的溶液中加入10mL甘氨酸浓度为0.1mol/L、NaCl浓度为1mol/L、pH值为3.0的溶液，充分摇匀10min，以3000r/min离心速率离心5min，在得到的上清中加入Tris-HCl缓冲溶液；/n五、重复步骤四三次，并将三次得到的溶液合并，得到溶液3MTHS1-2；/n六、向步骤四中弃去上清液后的溶液中加入2ml浓度为1mol/L、pH值为7.8的Tris-HCl缓冲溶液和25mLPBS缓冲溶液，以3000r/min离心5min，清洗2次；/n七、将3MTHS1-1按照步骤二-步骤五的步骤重复提取，得到提取液1；/n八、将3MTHS1-0按照步骤二-步骤五的步骤重复提取，得到提取液2；/n九、将提取液1、提取液2和溶液3MTHS1-2合并，进行5kDa超滤除盐，凝缩至2mL，再用10kDa的超滤离心管以4400r/min继续超滤至0.5mL，超滤过程中加水除盐3次，冷冻干燥，即得黑木耳凝集素。/n...

【技术特征摘要】
1.黑木耳凝集素的提取方法，其特征在于所述黑木耳凝集素的提取方法按照以下步骤进行：
一、称取干燥的黑木耳5g，加入100mL的磷酸盐缓冲液，在捣碎机中充分搅碎至粘稠的匀浆，每5min搅碎2次，两次之间将黑木耳匀浆放入冰浴中制冷3min，将黑木耳匀浆以5000r/min冷冻离心30min，收集上清液后采用四层FN15膜高压过滤，滤液为黑木耳凝集素粗提液3MTHS1-0；
二、将25mL3MTHS1-0与25mL猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B充分混合，于6℃搅拌过夜，次日以3000r/min离心5min，得到上清液3MTHS1-1；
三、将步骤二离心后的下层液分别用10mLPBS缓冲液洗三次，以3000r/min离心速率离心5min，弃去上清液；
四、解离：向步骤三所得的溶液中加入10mL甘氨酸浓度为0.1mol/L、NaCl浓度为1mol/L、pH值为3.0的溶液，充分摇匀10min，以3000r/min离心速率离心5min，在得到的上清中加入Tris-HCl缓冲溶液；
五、重复步骤四三次，并将三次得到的溶液合并，得到溶液3MTHS1-2；
六、向步...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彦龙，曾伟民，赵丹丹，雷虹，黄东，马成瑶，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23