本发明专利技术公开了重组腺相关病毒、其突变体及其构建方法和应用。本发明专利技术首先提供了包含rep cassette、cap cassette和ITRs cassette的重组腺相关病毒载体。本发明专利技术进一步将腺相关病毒的rep cassette进行单位点突变、双位点突变或多位点突变得到包装效率显著提高的系列突变体。本发明专利技术进一步提供了包含所述rep cassette的突变体的重组腺相关病毒载体以及构建方法。本发明专利技术所提供的重组腺相关病毒表达效率高，用这种病毒粒子向细胞中呈递基因比传统的病毒粒子更高，能够将目的基因高效呈递至细胞和脊椎动物体内，可作为基因呈递载体用于制备基因治疗药物。
【技术实现步骤摘要】
重组腺相关病毒、其突变体及其构建方法和应用
本专利技术涉及腺相关病毒，尤其涉及重组腺相关病毒、突变体及其构建方法，本专利技术进一步涉及它们在基因治疗中的应用，属于重组腺相关病毒及其应用领域。
技术介绍
腺相关病毒是一种单链DNA病毒，属于细小病毒家族的依赖病毒属。1965年作为腺病毒制备物中的一种污染成分首次被发现。作为一种缺陷型病毒，通常需要腺病毒或单纯疱疹病毒等才产生毒性感染，在可在哺乳动物细胞中长期潜伏感染。野生型AAV可以被改造成为重组载体，并能够携带外源基因，只需将病毒基因组两端的ITRs保留，rep和cap可以被外源基因所替代，通过其它方法携带rep和cap基因，从而反式提供这两种蛋白的功能，目前包装rAAV的方式主要有三种，质粒转染、构建稳定的细胞系和通过杆状病毒表达系统来包装。杆状病毒表达系统因其启动子可以对表达的蛋白进行加工修饰、且能够扩大生产规模，很早就被用来进行rAAV的生产，被EMA批准进入欧洲市场的Glybera就是用该系统生产的，常用AcNPV表达系统和BmNPV表达系统。早在几十年前，BEVS已被用于工业中大量生产重组蛋白，是一种较为经济可行的平台，可以用于生产rAAV病毒颗粒。即便如此，上述AcNPV-sf9细胞表达系统由于细胞培养的成本偏高，而导致病毒载体制备的价格昂贵。第一个商品化的AAV产品Glybera，它的单次治愈剂量的标价最初高达160万美元；美国获批的AAV产品Luxturna的销售定价为85万美元。所以生产成本是限制AAV作为基因治疗载体的关键因素之一。从生产成本看，据报道，仅用5个蚕蛹的外源蛋白的表达量相当于1升昆虫细胞的表达量，在家蚕幼虫的血淋巴中各类基因的表达量分别是sf细胞表达量的几十甚至上百倍。生产成本比细胞低几百倍，而且昆虫细胞培养的成本远远高于家蚕饲养成本。从安全性来看，家蚕作为鳞翅目昆虫，已经列入食品目录，僵蚕作为我国传统的名贵中药，已经被列入卫生部中药名录，这些都表明用家蚕杆状病毒表达系统生产rAAV的安全性是有保证的，且已成功利用三杆状病毒表达系统包装出rAAV，经过验证，具有感染哺乳动物并驱动目的基因表达的能力，不仅具有AcNPV-sf系统的优点，而且表达量更高，生产成本低几百倍，所以BmNPV-家蚕杆状病毒表达系统是一个潜力巨大的rAAV生产系统，其安全性和生产成本较低使其成为比较理想的rAAV生产系统，但其后续产品纯化技术还需进一步摸索，应用家蚕杆状病毒表达系统生产rAAV为解决目前因生产成本过高而限制AAV载体在基因治疗中应用的问题提供一种新思路，构建各型AAV的生产平台，能快速、高效地生产含各种目的基因的rAAV，这对rAAV更好的应用于基因治疗具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种包含repcassette、capcassette或ITRscassette的重组腺相关病毒载体；本专利技术的目的之二是将腺相关病毒的repcassette进行单位点突变、双位点突变或多位点突变得到包装效率显著提高的重组腺相关病毒系列突变体；本专利技术的目的之三提供包含所述repcassette的突变体的重组腺相关病毒载体；本专利技术的目的之四是提供所述重组腺相关病毒载体的构建方法；本专利技术的目的之五是将所述重组腺相关病毒载体作为基因呈递载体应用于制备基因治疗药物。为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案包括：本专利技术首先提供了一种重组腺相关病毒载体，包括repcassette，capcassette以及ITRscassette；其中，所述rep蛋白属于Ⅱ型腺相关病毒，其氨基酸序列为SEQIDNO.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示；所述的capcassette的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示；本专利技术所提供的重组腺相关病毒的ITRscassette的核苷酸序列为NC_001401.2所示，为了后期检测方面，将荧光素酶编码基因、绿色荧光蛋白编码基因和脂蛋白脂肪酶编码基因插入至ITRs序列中间，其中荧光素酶的核苷酸序列为MN519522.1所示，氨基酸序列为QKR72420.1所示；绿色荧光蛋白编码基因的核苷酸序列为JQ064510.1所示，氨基酸序列为AFA52654.1所示；脂蛋白脂肪酶编码基因为NM_000237.3所示，其氨基酸序列为NP_000228.1所示；其中，ITRs-Luccassette的核苷酸序列为SEQIDNO.5所示。具体的，本专利技术人分析了商品化腺相关病毒的序列，选择NCBI中登录号为NC_001401.2的Ⅱ型血清型的腺相关病毒序列，作为腺相关病毒的rep、cap和ITRcassette，在此基础上，本专利技术进一步在rep序列的5‘端加上BglⅡ序列和Kozak序列，在rep基因530位处加入intron序列，3’端加上HSVpolyA序列，终止密码子和XbaⅠ序列，即得repcassette；在cap序列5’端插入家蚕polh启动子序列、kozak序列和BamHI，在cap基因25位处加入intron序列，在3‘端加入终止密码子、BGHpolyA和EcoRⅠ序列，即得capcassette；为后期方便检测所获得腺相关病毒的完整性和表达效率，选择Luciferase、EGFP和LPL基因作为目的基因，并在ITR序列中间插入CMV启动子和多克隆位点，尾部插入SV40polyA，在ITR序列两端插入EcoRV和BglⅡ序列，即得ITRs-Luccassette、ITRs-EGFPcassette和ITRs-LPLcassette；最终，按照上述的方法得到的repcassette的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所述，capcassette的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示，ITRscassette的核苷酸序列为SEQIDNO.5所示。本专利技术将SEQIDNO.1所述的repcassette，SEQIDNO.2所示的capcassette和SEQIDNO.3所示的ITRscassette克隆进pVL1393载体中制备重组转移载体，得到三种重组杆状病毒。本专利技术将上述三种重组杆状病毒等比例混合感染家蚕细胞或宿主，得到包装良好的重组腺相关病毒。本专利技术为了提高重组腺相关病毒的表达效率，进一步将SEQIDNO.1所示的repcassette进行单位点突变，双位点突变或多位点突变以提高其表达效率。本专利技术以重组腺相关病毒载体中repcassette的基因序列为模板，设计多对引物对rep序列进行定点突变：将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列按照W29G、F63S、P163T、P281C、A313Y、P440T、F458C、V486G、V508W或L569T的氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体；本专利技术将突变后的这些单位点突变体在家蚕表达系统中进行表达，根据qPCR结果可见：将SEQIDN本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.腺相关病毒rep cassette的突变体，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸按照F63S、P281C、F458C或V486G所示的任何一种氨基酸单位点突变获得的突变体。/n
【技术特征摘要】
1.腺相关病毒repcassette的突变体，其特征在于，将SEQIDNO.1所示的氨基酸按照F63S、P281C、F458C或V486G所示的任何一种氨基酸单位点突变获得的突变体。
2.腺相关病毒repcassette的突变体，其特征在于，将SEQIDNO.1所示的氨基酸按照F63S-P281C、F63S-F458C、F63S-V486G、P281C-F458C、P281C-V486G或F458C-V486G所示的任何一种氨基酸双位点突变获得的突变体。
3.腺相关病毒repcassette的突变体，其特征在于，将SEQIDNO.1所示的氨基酸按照F63S-P281C-V486G所示的氨基酸多位点突变获得的突变体。
4.权利要求1-3任何一项所述的突变体在构建重组腺相关病毒载体中的用途。
5.一种重组腺相关病毒载体，包括repcassette、capcassette和ITRscassette，其特征在于，所述的repcassette的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。
6.一种重组腺相关病毒载体，包括repcassette、capcassette和ITRscassette，其特征在于，所述capcassette的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示。
7.一种重组腺相关病毒载体，包括repcassette、capcassette和ITRscassette，其特征在于，所述ITRscassette的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.5所示。
8.一种重组腺相关病毒载体，包括repcassette、capcassette和ITRscassette，其特征在于，所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：李轶女，张志芳，刘兴健，杜梦潭，尚玉婷，易咏竹，鲁念，高维崧，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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