本发明专利技术公开了玉米ZmBES1/BZR1‑2基因在提高植物耐旱性中的应用，从玉米幼苗叶片中分离获得ZmBES1/BZR1‑2基因，构建35S‑ZmBES1/BZR1‑2‑eGFP载体，通过农杆菌介导法将前述载体转化入植物，该基因在植物中过表达，转基因后的植物抗旱性提升，证实玉米ZmBES1/BZR1‑2基因在改善植物耐旱性中的作用。
【技术实现步骤摘要】
玉米ZmBES1/BZR1-2基因在提高植物耐旱性中的应用
本专利技术涉及玉米ZmBES1/BZR1-2基因在提高植物耐旱性中的应用，属于基因工程领域。
技术介绍
近年来，针对人们不合理耕种及其工业的进一步发展，中国土壤干旱程度进一步加深，而干旱是影响玉米产量的重要因素，选育具有耐旱性状的植株有利于农业生产、增产和经济发展。耐旱性是一个复杂的数量性状，植物受到干旱胁迫，感知逆境信号，并启动相关耐旱基因做出一系列调控直至表现出耐旱性。利用现代分子生物学技术，近二十年年来对玉米抗旱研究获得众多重要的研究进展。专利CN201910026520.2玉米抗旱基因ZmDSR的克隆及其应用中，公开了玉米抗旱基因ZmDSR提高玉米品种耐干旱胁迫能力的应用，用引物ZmDSR-Cloning扩增ZmDSR基因，构建ZmDSR的过量表达载体，对拟南芥进行遗传转化。该基因在拟南芥植株中的过量表达，可以显著提高植株的耐旱性。专利CN201910274035.7玉米抗旱相关基因ZmDi19-7及其应用中，公开基因ZmDi19-7的序列及其在植物抗旱调控机制中的主要作用。在刘松涛等人发表的《玉米ERD基因的表达模式及ZmERD6基因的抗旱性分析》中筛选出5个ZmERD基因，利用旱胁迫实验发现GRMZM2G109201，GRMZM2G181206和GRMZM2G12864基因属于组成型表达，GRMZM2G134192基因属于特异型表达，只在花药中高表达。属于ERD6亚家族的GRMZM2G109201基因在旱敏感型(B73)和抗旱型(郑58)自交系中均表达，且郑58中表达量显著高于B73；随着旱胁迫时间的延长，GRMZM2G109201基因在B73中表达量差异不显著，但在郑58中表达量升高幅度达到显著水平，亚细胞定位显示，GRMZM2G109201基因编码的ZmERD6蛋白定位于质膜，推测GRMZM2G109201基因参与旱胁迫，且被正向诱导。随着越来越多的玉米抗旱基因的发现，这都为玉米抗旱提供理论基础，但是在现有的抗旱研究中针对玉米ZmBES1/BZR1-2基因功能性分析尚未报道，也没有利用该基因改善作物耐旱性的方法。
技术实现思路
本专利技术克服了上述现有技术的不足，提供玉米ZmBES1/BZR1-2基因在提高植物耐旱性中的应用，本专利技术在玉米幼苗叶片中分离获得ZmBES1/BZR1-2基因，通过该基因在植物中的过表达，验证玉米ZmBES1/BZR1-2基因在改善植物耐旱性中的作用。玉米ZmBES1/BZR1-2基因在提高植物耐旱性中的应用。进一步的，上述应用中所述的ZmBES1/BZR1-2基因的序列如SEQIDNO.1所示。进一步的，上述玉米ZmBES1/BZR1-2基因在提高植物耐旱性中的应用的应用方法，包括如下步骤：在玉米幼苗叶片中分离获得ZmBES1/BZR1-2基因，设计ZmBES1/BZR1-2基因的扩增引物，通过PCR方法扩增玉米ZmBES1/BZR1-2基因的cDNA序列，然后利用ZmBES1/BZR1-2的cDNA序列构建35S-ZmBES1/BZR1-2-eGFP载体，利用农杆菌介导法将前述载体转化入植物，提高ZmBES1/BZR1-2基因的表达，得到ZmBES1/BZR1-2基因过表达的植株。进一步的，上述应用方法中所述的35S-ZmBES1/BZR1-2-eGFP载体序列如SEQIDNO.2所示。一种培育抗旱植物的方法：上调植物中ZmBES1/BZR1-2基因的表达，以获得抗旱的植株。有益效果：本专利技术在玉米中发现ZmBES1/BZR1-2基因，分离克隆该基因，并首次在拟南芥中过量表达了ZmBES1/BZR1-2基因，明确了玉米ZmBES1/BZR1-2基因可提高植物的耐旱性，为培育抗干旱、抗盐转基因植物提供了新思路。对农作物抗旱育种及生产应用具有重要的指导意义，具有广阔的应用前景。附图说明图1在1/2MS培养基上获得阳性苗。图2阳性苗基因组水平检测目的基因插入。图3反转录PCR(RT-PCR)检测目的基因表达。图41/2MS培养基上各株系根长及丙二醛含量。图5胁迫培养基上各株系根长及丙二醛含量。图6干旱处理后表型。具体实施方式为了使本
人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1.基因克隆及载体构建取五叶期玉米幼苗叶片，液氮速冻研磨，使用总RNA提取试剂盒Trizol(TaKaRa)并按照其说明书提取总RNA。用PrimeScriptTMRTregeantKit试剂盒(Takara公司)，以总RNA为模板进行cDNA的合成。用NCBI网站Primeblast设计ZmBES1/BZR1-2基因的扩增引物，根据双子叶植物表达载体pCAMBIA2300-35S-eGFP多克隆位点，在其上游引物入BamHI酶切位点(序列如SEQIDNO.3)，下游引物引入SpeI位点(序列如SEQIDNO.4)，具体序列如表1：表1双构建子叶植物表达载体引物设计按表2所示反应体系加样，进行扩增。温度循环程序为：94℃3min；98℃10s，最适退火温度10s，72℃20s，30个循环；72℃5min；4℃保持。表2PCR扩增反应体系对PCR产物进行回收。将回收产物，pCAMBIA2300质粒进行双酶切，按表3反应体系进行加样。将酶切体系混匀，置于30℃水浴锅中，酶切6～8h，酶切产物加入上样缓冲液后，直接电泳，回收酶切产物，按表4进行酶切片段连接。表3双酶切加样体系表4连接反应体系连接产物转化大肠杆菌，并进行菌落PCR检测。提取重组质粒经限制性内切酶双酶切鉴定之后，组质粒菌液送测序公司进行DNA的序列测序鉴定，经测序正确的质粒将于下一步拟南芥转化。2.拟南芥转化及阳性鉴定为探索玉米ZmBES1/BZR1-2的功能，我们用农杆菌介导的花絮浸染法将35S-ZmBES1/BZR1-2-eGFP载体转化拟南芥突变体bes1-D。2.1花序浸染法转化(1)取含有重组质粒的农杆菌，在含有卡那霉素(Kana)和利福平(Rif)的YEP平板上划线，28℃培养2～3d。(2)挑取农杆菌单菌落接种在3mL含Kana和Rif的YEP液体培养基中，28℃，200r/min，振荡过夜培养。(3)在100mL液体YEP培养基中(含Kana和Rif)，接种1mL过夜培养的起始农杆菌菌液，28℃振荡培养至菌液OD600值为1.2～1.5。(4)4℃5000r/min离心10min收集细胞，用5％蔗糖溶液悬浮菌体并调OD600值至0.8～1.0，按0.01％～0.02％的比例加入表面活性剂silwetL-77。(5)用拟南芥专用营养土盆栽本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.玉米ZmBES1/BZR1-2基因在提高植物耐旱性中的应用。/n
【技术特征摘要】
1.玉米ZmBES1/BZR1-2基因在提高植物耐旱性中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的ZmBES1/BZR1-2基因的序列如SEQIDNO.1所示。
3.如权利要求1所述的应用的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：
设计ZmBES1/BZR1-2基因的扩增引物，通过PCR方法扩增玉米ZmBES1/BZR1-2基因的cDNA序列，然后利用ZmBES1/BZR1-2的cDNA序列构建35S-ZmBES1/BZR1-2-eGFP载体，利用农杆菌介导法将前述载体转...
【专利技术属性】
技术研发人员：于好强，冯文奇，刘媛，付凤玲，李晚忱，杨青青，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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