本发明专利技术涉及模式植物拟南芥的一个基因的抗病性功能，属于植物病理学研究领域。本发明专利技术公开了拟南芥基因AT5G02580，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术还同时公开了上述拟南芥基因AT5G02580的用途/功能：在拟南芥中敲除AT5G02580基因可显著增加植株的抗病性。本发明专利技术先设计AT5G02580基因靶向敲除的sgRNA序列，再构建载体，载体遗传转化拟南芥，从而获得相应的转基因植株，从转基因植株中鉴定出AT5G02580基因的两个不同突变类型的株系ko‑1和ko‑2。
【技术实现步骤摘要】
增强植物抗病性的基因及其功能
本专利技术涉及模式植物拟南芥一个基因的抗病性功能，属于植物病理学研究领域。
技术介绍
拟南芥由于其基因组小、种植方便、生长周期短等特点，成为全球植物学各方面研究的首先模式植物。自1993年Staskawicz团队首次在拟南芥中克隆了抗病基因RPS2以来，目前科学家已在拟南芥中发现了大量抗病基因，形成了较为系统的抗病调控网络，使拟南芥在植物抗病育种领域中成为不可替代的明星植物。病原菌侵害是影响植物生长发育的胁迫之一，其中丁香假单孢杆菌番茄致病变种(Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000，PstDC3000)是拟南芥病原菌侵害研究的主要模式菌种，近年来科学家利用PstDC3000发现了许多抗病基因，比如Wang等(2017)发现敲除IDL6基因能增强拟南芥对PstDC3000的抗性；Andrew等(2001)通过在拟南芥中敲除COI1基因也能植株对PstDC3000的抗性增强。因此，利用模式植物发掘更多抗病相关基因，对作物抗病育种具有重要的借鉴意义。基因AT5G02580的序列虽然已被公开于TheArabidopsisInformationResource数据库https://www.arabidopsis.org/，但是该基因的功能及其用途未知。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何发掘更多植物抗病新基因及功能，指导作物抗病育种。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一个模式植物拟南芥的基因AT5G02580，其编码蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还同时提供了上述基因的用途/功能：在拟南芥中敲除AT5G02580基因可显著增加植株(拟南芥)的抗病性。作为本专利技术的用途/功能的改进：ko-1的AT5G02580基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，ko-2的AT5G02580基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术还同时提供了在拟南芥中敲除AT5G02580基因的方法，包括以下步骤：1)、利用CRISPR/Cas9技术，设计AT5G02580基因靶向敲除的sgRNA序列：5'-GAATGTATAGTATTCAACA-3’；2)、利用步骤1)的序列合成引物，并构建CRISPR/Cas9载体中；3)、将步骤2)所得的载体遗传转化拟南芥(野生型品种Col-0)，从而获得相应的转基因植株；从所述转基因植株中鉴定出AT5G02580基因的两个不同突变类型的株系ko-1和ko-2。本专利技术的技术方案具体如下：采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，根据AT5G02580基因编码蛋白的核苷酸序列(SEQIDNO:1)，合成特异性靶向AT5G02580基因的sgRNA序列，并构建相应的CRISPR/Cas9载体，遗传转化到拟南芥野生型品种Col-0中，获得转基因植株，对转基因植株中AT5G02580基因进行PCR扩增与测序，鉴定获得了AT5G02580基因两类不同的突变株系ko-1(丢失1个碱基)和ko-2(插入1个碱基)(图1)，均导致AT5G02580基因发生移码突变，即，敲除该基因。其中，ko-1突变株系的植株中AT5G02580基因序列为SEQIDNO:2，ko-2突变株系的植株中AT5G02580基因序列为SEQIDNO:3。本专利技术经接种病原菌PstDC3000鉴定抗病性发现，ko-1和ko-2植株比拟南芥野生型品种Col-0的抗病性显著性提高(图2)，其叶片的病斑面积显著性低于野生型(图3)，表明在拟南芥中敲除AT5G02580基因能有效提高植株对病原菌的抗性，对作物抗病育种具有借鉴价值。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1为拟南芥野生型品种Col-0、ko-1和ko-2突变植株的AT5G02580基因测序比对。图2为拟南芥野生型品种Col-0、ko-1和ko-2突变植株侵染病原菌PstDC3000后叶片发病情况。图3为拟南芥野生型品种Col-0、ko-1和ko-2突变植株侵染病原菌PstDC3000后叶片的病斑面积统计；图3中的数值为平均值±标准差，**表示ko-1或ko-2突变植株与拟南芥野生型品种Col-0之间经t检验分析，存在极显著性差异(P<0.01)。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1、AT5G02580基因敲除载体的构建根据AT5G02580基因序列(SEQIDNO:1)，设计CRISPR/Cas9敲除的靶向sgRNA序列：5'-GAATGTATAGTATTCAACA-3’，根据该序列合成相应的引物5'-TGATTGGAATGTATAGTATTCAACA-3’与5'-AAACTGTTGAATACTATACATTCCA，并采用CRISPR/Cas9试剂盒(Biogle，China)构建AT5G02580基因的敲除载体，构建方法按照产品说明进行操作。实施例2、拟南芥的遗传转化将实施例1构建的CRISPR/Cas9载体遗传转化到拟南芥野生型品种Col-0中，转化方法参照文献(PlantJournal,1998,16(6):735-743)，获得相应的转基因拟南芥植株ko-1和ko-2。实施例3、AT5G02580基因敲除植株的鉴定DNA提取：取拟南芥野生型品种Col-0与转基因植株的新鲜叶片0.1g，用液氮研磨后加300μL的提取液(0.1mol/LTris-HClpH8.0，500mmol/LNaCl，1.25g/LSDS)，65℃温育1h，期间摇2～3次，加100μL的5mol/LKAC，摇匀后，冰浴10min，再加250μL氯仿，混匀，静置5min后8000r/min离心10min，取250μL上清液转移至1.5ml的新管中，加入250μL预冷的异丙醇摇匀至絮状沉淀出现，冷藏10min，12000r/min，4℃，离心5min，弃上清，加1mL70％乙醇，12000r/min离心7min弃上清，倒置室温风干，加80μLddH2O混匀，-20℃保存备用。PCR扩增：合成AT5G02580基因PCR扩增的引物：上游5'-GTGACTATAGCATCTATCATCCTTCA-3'，下游5'-TTTCGCTAGCTCTTTCCACAC-3'，以拟南芥野生型品种Col-0与转基因植株的DNA为模板，用2×TaqPCR试剂(天根，北京)进行PCR扩增。PCR扩增体系为：1μL模板DNA、10μL2×TaqPCRMasterMixⅡ、1μL引物(上游+下游混合，10μM)，ddH2O补足至20μL。PCR扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸2min。PCR产物经测序分析后，成功鉴定了AT5G02580基因的2种突变类型植株本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.拟南芥基因AT5G02580，其特征是：该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n
【技术特征摘要】
1.拟南芥基因AT5G02580，其特征是：该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
2.如权利要求1所述的拟南芥基因AT5G02580的用途/功能，其特征是：在拟南芥中敲除AT5G02580基因能增加植株的抗病性。
3.根据权利要求2所述的拟南芥基因AT5G02580的用途/功能，其特征是：
ko-1的AT5G02580基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，
ko-2的AT5G02580基因的核苷酸序列如SEQIDNO:...
【专利技术属性】
技术研发人员：马紫程，沈淑容，陈析丰，马伯军，
申请(专利权)人：浙江师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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