一种高效分离人实体瘤相关中性粒细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效分离人实体瘤中性粒细胞的方法，包括利用木瓜蛋白酶介导的肿瘤组织分离制备单细胞悬液与CD66B介导的流式细胞术分析单细胞悬液相结合获取中性粒细胞的步骤。本发明专利技术通过建立木瓜蛋白酶介导的组织解离和CD66B介导FACS在GANs分离中组合应用，对脑胶质瘤组织中性粒细胞进行分离，经实验验证，经木瓜蛋白酶介导的胶质瘤组织分离获得的活细胞数平均达到6.3×10

【技术实现步骤摘要】
一种高效分离人实体瘤相关中性粒细胞的方法
本专利技术涉及生物医药
，特别是涉及一种高效分离人实体瘤相关中性粒细胞的方法。
技术介绍
免疫细胞在肿瘤进展中发挥着双重作用。在自发性免疫系统中，肿瘤相关基因突变产生多种新抗原，如EGFRvIII，bcr-abl，ERG和LMP2。这些新抗原会被抗原呈递细胞(如树突状细胞，单核细胞和B淋巴细胞等)吸收，通过MHC-II复合物呈递，然后被T细胞抗原受体(TCR)识别，激活T或B淋巴细胞。活化的CD8+T细胞能够产生穿孔素，丝氨酸酯和淋巴毒素，从而杀伤肿瘤细胞。活化的B细胞可产生抗原特异性抗体和IL-2等白细胞介素，调节肿瘤的免疫监视。同时，T，B淋巴细胞分泌的IFN和IL-2可募集和激活天然免疫细胞如NK细胞，NK细胞产生TNF和颗粒酶B直接杀伤肿瘤细胞。这些自发的免疫过程会抑制肿瘤的生长和进展。在肿瘤适应免疫系统中，高进化的癌细胞如肿瘤干细胞可分泌CCL2，IL-6，IL-10，募集多种免疫抑制调节性细胞如调节性T细胞和髓系源性抑制细胞，以抑制细胞毒性CD8+T细胞，B细胞和NK细胞诱导的免疫应答。此外，进化的癌细胞还直接改变了几种先天免疫细胞的命运，如恶性肿瘤细胞分泌IL-4，IL-13，IL-17和TGF，使肿瘤相关的巨噬细胞极化为促肿瘤表型，这些肿瘤相关的免疫细胞不仅诱导肿瘤的免疫逃逸，而且促进肿瘤的生长，血管生成，侵袭和转移，形成恶性表型。这些发现不仅拓展了我们对肿瘤生物学的认识，而且为肿瘤免疫治疗的发展提供了前景。然而，我们目前对免疫细胞分化的认识是建立在小鼠模型上的，免疫细胞在人源性肿瘤组织中的功能作用还有待研究。作为循环中最丰富的白细胞，中性粒细胞传统上被认为是防御宿主免受微生物入侵和辅助伤口愈合的作用。然而，大量资料表明，中性粒细胞在肿瘤进展中起着关键作用。例如，中性粒细胞胞外陷阱(NET)相关蛋白酶可以切割层粘连蛋白，而蛋白水解重塑的层粘连蛋白激活整合素信号通路，从而诱导休眠癌细胞增殖。此外，NET-DNA可被跨膜受体CCDC25感知，激活ILK-parvin通路，促进肿瘤细胞转移。此外，此外，手术及放疗均能诱导Ly6G+中性粒细胞向肿瘤区域浸润。其中手术招募的中性粒细胞能够导致胶质瘤细胞死亡，从而造成局部坏死，进而导致肿瘤恶化。放疗招募的中性粒细胞则能够通过NOS2-NO-ID4调控胶质瘤细胞逆分化为胶质瘤干细胞。然而，这些关于中性粒细胞功能的发现主要来自小鼠。由于中性粒细胞在体外的寿命较短，患者来源的胶质瘤相关中性粒细胞(GANs)的生理功能尚不明确，而从实体肿瘤中分离中性粒细胞仍是一个难题。外周血中的中性粒细胞通常通过Ficoll分离，该方法基于密度梯度离心法。但这种方法可能不适合从实体肿瘤中分离中性粒细胞，因为肿瘤组织中的细胞组成比血液中的复杂。流式细胞仪可根据单个荧光结合抗原抗体反应产生的多重荧光信号，分离或监测特定谱系细胞。因此，流式细胞荧光分选技术(FACS)通常应用于通过多种组合表面标记物从全血中分离免疫细胞。在实体瘤中，分离GANs的第一步是组织分离，这一过程会导致细胞表面蛋白(包括细胞谱系特异性标记物)的物理或化学破坏，不利于表面抗原介导的分离。因此，需要探索一种合适的实体瘤分离方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效分离脑胶质瘤相关中性粒细胞的方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过将木瓜蛋白酶介导的组织分离和CD66B介导的流式细胞术的结合，实现患者来源肿瘤中性粒细胞的高效分离。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种高效分离人实体瘤中性粒细胞的方法，包括利用木瓜蛋白酶介导的肿瘤组织分离制备单细胞悬液与CD66B介导的流式细胞术分析单细胞悬液相结合获取中性粒细胞的步骤。优选的是，木瓜蛋白酶介导的肿瘤组织分离制备单细胞悬液具体包括以下方法步骤：将脱氧核糖核酸酶和木瓜蛋白酶混合液加入肿瘤中混合，于37℃孵育1-45min，离心收集细胞颗粒；将所述细胞颗粒重悬于卵粘蛋白抑制剂-白蛋白中，再用碎片去除溶液处理，之后离心，收集沉淀并用PBS/无菌水混合液裂解，获取单细胞悬液。优选的是，所述脱氧核糖核酸酶和木瓜蛋白酶混合液是脱氧核糖核酸酶和木瓜蛋白酶按体积比1:1-1:20(优选1:10)混合而成；按肿瘤质量计，所述脱氧核糖核酸酶和木瓜蛋白酶混合液按100-500μL/g(优选300μL/g)的浓度加入肿瘤中。优选的是，离心条件为：1000rpm离心5min。优选的是，PBS/无菌水混合液为PBS与无菌水按体积比1:1-1:5混合而成。优选的是，CD66B介导的流式细胞术分析单细胞悬液包括以下步骤：将所制备的单细胞悬液离心后收集细胞颗粒，并将细胞颗粒重悬于FBS-PBS溶液中，室温下用人BDFc阻断剂阻断10min，依次洗涤、染色、再洗涤细胞后，用流式细胞仪检测CD66B+/CD15+细胞比例，并分选CD66B+中性粒细胞。优选的是，所述离心条件为：1500rpm离心5min。优选的是，所述实体瘤包括脑胶质瘤。本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术公开的高效分析人实体瘤相关中性粒细胞的方法，改变常规分离中性粒细胞大多是在小鼠模型或HL-60(人早幼粒细胞急性白血病细胞系)分化中性粒细胞样细胞中进行。而本专利技术通过建立木瓜蛋白酶介导的组织分离和CD66B引导的FACS在GANs分离中的组合应用，实验验证，木瓜蛋白酶介导的脑胶质瘤组织分离获得的活细胞数平均达到6.3×106cells/g，同时检测到经木瓜蛋白酶15min消化，97％的CD66B被保留，可见，该分离方法不仅成功分离出脑胶质瘤相关中性粒细胞，还提高了细胞的活力，保持了中性粒细胞表面抗原，还增强了抗原抗体的相互作用，为进一步了解人源性肿瘤浸润中性粒细胞的生物学功能提供了技术支持。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为苏木精-伊红染色不同级别脑胶质瘤组织评估中性粒细胞在人脑胶质瘤组织中的分布情况；A-D为不同级别脑胶质瘤组织中中性粒细胞的浸润情况；E为不同级别脑胶质瘤组织中中性粒细胞所占百分比；图2为木瓜蛋白酶消化和物理研磨脑胶质瘤组织分离效果对比；A为物理研磨法处理脑胶质瘤组织示意图；B为木瓜蛋白酶消化处理脑胶质瘤组织示意图；C为物理研磨、胰蛋白酶消化以及木瓜蛋白酶消化脑胶质瘤组织后的活细胞数量分析；D为用木瓜蛋白酶消化处理不同时间后CD66B+细胞百分率比较；图3为筛选适宜GANs的分离的表面标记物；A为通过CD15与CD66B联合标记中性粒细胞的流式检测结果，B为联合CD44和CD66B评估脑胶质瘤组织中的中性粒细胞免疫荧光分析图；C为CD44+细胞分布百分比；D为中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和嗜碱性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效分离人实体瘤中性粒细胞的方法，其特征在于，包括利用木瓜蛋白酶介导的肿瘤组织分离制备单细胞悬液与CD66B介导的流式细胞术分析单细胞悬液相结合获取中性粒细胞的步骤。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效分离人实体瘤中性粒细胞的方法，其特征在于，包括利用木瓜蛋白酶介导的肿瘤组织分离制备单细胞悬液与CD66B介导的流式细胞术分析单细胞悬液相结合获取中性粒细胞的步骤。


2.如权利要求1所述的一种高效分离人实体瘤中性粒细胞的方法，其特征在于，木瓜蛋白酶介导的肿瘤组织分离制备单细胞悬液具体包括以下方法步骤：
将脱氧核糖核酸酶和木瓜蛋白酶混合液加入肿瘤中混合，于37℃孵育1-45min，离心收集细胞颗粒；
将所述细胞颗粒重悬于卵粘蛋白抑制剂-白蛋白中，再用碎片去除溶液处理，之后离心，收集沉淀并用PBS/无菌水混合液裂解，获取单细胞悬液。


3.如权利要求2所述的一种高效分离人实体瘤中性粒细胞的方法，其特征在于，所述脱氧核糖核酸酶和木瓜蛋白酶混合液是脱氧核糖核酸酶和木瓜蛋白酶按体积比1:1-1:20混合而成；
按肿瘤质量计，所述脱氧核糖核酸酶和木瓜蛋白酶混合液按100-500μL/g的浓度加入肿瘤中。


4.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：金勋，徐星，
申请(专利权)人：天津医科大学肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：天津;12