一种杜仲各部位全株诱导植物再生及构建转基因植株再生体系的方法技术

本发明专利技术提供了一种杜仲各部位全株诱导植物再生及构建转基因植株再生体系的方法，属于木本植物组织培养技术领域。本发明专利技术提供的以杜仲各部位全株诱导植物再生的方法，包括如下步骤：以杜仲种胚、茎部和/或根部诱导获得愈伤组织，愈伤组织分化培养、生根培养获得完整的杜仲再生植株；所述分化培养的培养基为：基础培养基+0.5‑2mg/L6‑BA+1.0‑2.0mg/LIAA+25‑35g/L蔗糖+8‑10g/L琼脂，pH为5.8‑6。本发明专利技术提供的可以通过杜仲的根、茎、种胚多个部位进行植株再生的方法，具有更广泛的应用范围，可以根据需要，选择相应的部位进行再生，得到的组培再生幼苗具有相应的优良性状，培育出的组培苗苗龄，生长状态保持一致且良好，不易染菌，不易褐化，分化率和生根率较高。

【技术实现步骤摘要】
一种杜仲各部位全株诱导植物再生及构建转基因植株再生体系的方法
本专利技术属于木本植物组织培养
，尤其涉及一种杜仲各部位全株诱导植物再生及构建转基因植株再生体系的方法。
技术介绍
杜仲(学名EucommiaulmoidesOliver)，又名胶木，为杜仲科杜仲属植物，树高可达20米，胸径约50厘米，是我国野生药用和经济植物资源。我国每年对于天然橡胶的需求量极高，每年消费的天然橡胶量位列世界首位。我国天然橡胶主要以海南的三叶橡胶为原材料。三叶橡胶为热带植物，在我国适合其生长的地区很少，只能在海南，西双版纳等地区栽培，并且产量已经达到上限，所以目前我国三叶橡胶资源匮乏。为了满足国内的橡胶需求，我国严重依赖于进口橡胶。而杜仲植物的果实、树皮、叶和根中均含有丰富的结构为反式聚异戊二烯的杜仲胶，具有热塑性、热弹性和橡胶弹性等优点，可以作为海南三叶橡胶的替代资源，成为我国天然橡胶的战略储备资源。由于杜仲具有较高经济价值，近年来大批量的培养也成为现在比较值得关注的问题，但杜仲属于木本植物，传统的种植对生长环境条件要求较高，生长周期长。现阶段杜仲胶的产量过低而生产成本相对过高，这在很大程度上制约了杜仲胶的应用和产业的发展。如今植物组培技术日益成熟，可以从植物中分离出具有优良性状或携带目的基因的组织、器官、细胞或原生质体等，在人工控制条件下进行培养，获得再生的完整植株。但目前杜仲的植物组培技术还停留在扦插，嫁接等阶段。扦插，嫁接的植物组培技术存在生根率、出芽率低等弊端，所以杜仲的植物组培技术还有待完善。建立各个部位的再生体系，可以高效，快速得到完整的杜仲组培植株。因此建立杜仲各个部位的再生体系，对于推动我国杜仲产业的发展十分重要。植物组织再生技术可以通过对植株的不同部位再生幼苗，由此得到性状优良，苗龄一致，长势均一的杜仲组培苗。不同部位再生出的幼苗具有不同的性状特点，再生效率也各不相同。因此可以根据需要，挑选不同的植株部位进行再生，最终得到所需性状的植株。例如一些植物基因具有组织特异性，可以针对不同组织基因的表达情况进行幼苗再生，得到相关基因表达量较高的植株。再比如，植株不同部位积累的次生代谢产物有可能不同，可以通过单个部位的植物组织再生，得到某种次生代谢产物积累较高的再生植株。所以植物各部位全株诱导植物再生的方法，为相关的科学研究提供良好的技术手段，也对于生产实践领域具有重大意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种杜仲各部位全株诱导植物再生的方法，以杜仲根，茎，种胚为外植体高效诱导获得杜仲再生苗，并且成活率高、周期短，可显著提高杜仲的再生效率。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种杜仲各部位全株诱导植物再生的方法，包括如下步骤：以杜仲种胚、茎部和/或根部诱导获得愈伤组织，愈伤组织分化培养、生根培养获得完整的杜仲再生植株；所述分化培养的培养基为：基础培养基+0.5-2mg/L6-BA+1.0-2.0mg/LIAA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。优选的，所述以杜仲种胚诱导获得愈伤组织的诱导培养基为：基础培养基+4.5-5.5mg/L2,4-D+0.4-0.6mg/LZT+480-520mg/L脯氨酸+480-520mg/L谷氨酰胺+14-16g/L葡萄糖+28-30g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。优选的，所述以杜仲茎部诱导获得愈伤组织的诱导培养基为：基础培养基+0.5-1.0mg/L6-BA+0.5-1.0mg/LIAA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。优选的，所述以杜仲根部诱导获得愈伤组织的诱导培养基为：基础培养基+2-2.5mg/L6-BA+1-1.5mg/LNAA+700-800mg/L脯氨酸+500-600mg/LLH+30-40g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。优选的，所述生根培养的培养基为：基础培养基+30-35g/L蔗糖，pH为5.8-6。本专利技术还提供了一种杜仲转基因植株再生体系的构建方法，包括如下步骤：将含目标基因重组载体的发根农杆菌悬浮液注射到上述任意一项所述方法获得的杜仲再生幼苗的茎部，待杜仲幼苗茎部伤口处的愈伤组织分化为再生毛状根，以再生毛状根为外植体，组织培养，直至获得完整的杜仲转基因幼苗。优选的，所述注射的位置位于幼苗原始毛状根系上方0.5-1.5cm处的茎部。优选的，所述组织培养的愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+2-2.5mg/L6-BA+1-1.5mg/LNAA+700-800mg/L脯氨酸+500-600mg/LLH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8。优选的，所述组织培养的愈伤组织分化培养基为：基础培养基+1.0-1.5mg/L6-BA+1.0-1.5mg/LIAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8。优选的，所述组织培养的生根培养基为：基础培养基+30-35g蔗糖，pH为5.8-6。本专利技术的有益效果：本专利技术可以通过杜仲的根，茎，种胚多个部位进行植株再生，具有更广泛的应用范围。而且可以根据需要，选择相应的部位进行再生，得到的组培再生幼苗具有相应的优良性状。经本专利技术的方法培育出的组培苗苗龄一致，生长状态保持一致且良好，不会染菌，不易褐化，分化率和生根率均较高。本专利技术提供的获得杜仲转基因植株再生体系的方法，通过发根农杆菌注射完成杜仲根系转基因，并通过根系的再生体系，将其快速高效的培养成为转基因植株，操作简单，转化率和成活率都很高。附图说明图1为杜仲根部再生不同阶段的生长状态，其中A为转基因根愈伤组织诱导，B为愈伤组织生长，C为愈伤组织分化前期出现个别小芽，D为愈伤组织分化后期长出很多嫩芽，E为芽继续分化为幼苗，F为幼苗生根；图2为杜仲茎部再生不同阶段的生长状态，A为茎部愈伤组织诱导，B为愈伤组织生长，C为愈伤组织分化前期出现个别小芽，D为愈伤组织分化后期长出很多嫩芽，E为芽继续分化为幼苗，F为幼苗生根；图3为杜仲种胚再生不同阶段的生长状态，A为种胚愈伤组织诱导，B为愈伤组织生长，C为愈伤组织分化前期出现个别小芽，D为愈伤组织分化后期长出很多嫩芽，E为芽继续分化为幼苗，F为幼苗生根；图4为杜仲转基因毛状根系的RT-PCR和蛋白质印迹分析，CK为对照，T1和T2表示两个转基因系；图5为杜仲根，茎，种胚的愈伤组织诱导率、分化率、生根率和杜仲根部转基因结果。具体实施方式本专利技术提供了一种杜仲各部位全株诱导植物再生的方法，包括如下步骤：以杜仲种胚、茎部和/或根部诱导获得愈伤组织，愈伤组织分化培养、生根培养获得完整的杜仲再生植株；所述分化培养的培养基为：基础培养基+0.5-2mg/L6-BA+1.0-2.0mg/LIAA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。在本专利技术中，以杜仲种胚诱导获得再生植株，为植物遗传育种、次生代谢产物提供原料。以植物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杜仲各部位全株诱导植物再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：以杜仲种胚、茎部和/或根部诱导获得愈伤组织，愈伤组织分化培养、生根培养获得完整的杜仲再生植株；所述分化培养的培养基为：基础培养基+0.5-2mg/L 6-BA+1.0-2.0mg/L IAA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。/n

【技术特征摘要】
1.一种杜仲各部位全株诱导植物再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：以杜仲种胚、茎部和/或根部诱导获得愈伤组织，愈伤组织分化培养、生根培养获得完整的杜仲再生植株；所述分化培养的培养基为：基础培养基+0.5-2mg/L6-BA+1.0-2.0mg/LIAA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述以杜仲种胚诱导获得愈伤组织的诱导培养基为：基础培养基+4.5-5.5mg/L2,4-D+0.4-0.6mg/LZT+480-520mg/L脯氨酸+480-520mg/L谷氨酰胺+14-16g/L葡萄糖+28-30g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述以杜仲茎部诱导获得愈伤组织的诱导培养基为：基础培养基+0.5-1.0mg/L6-BA+0.5-1.0mg/LIAA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述以杜仲根部诱导获得愈伤组织的诱导培养基为：基础培养基+2-2.5mg/L6-BA+1-1.5mg/LNAA+700-800mg/L脯氨酸+500-600mg/LLH+30-40g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。

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【专利技术属性】
技术研发人员：杨清，孟冬，杨琬珑，付玉杰，杜婷婷，刘腾跃，董碧莹，宋治华，祁萌，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11